GPR30在子宫肌瘤组织中的表达

朱虹 徐学麟 江秀秀 叶小磊 林俊*

作为女性生殖器最常见的良性肿瘤，子宫肌瘤的病因目前尚未明确。有研究指出G蛋白偶联受体（GPR30）通过影响细胞周期的进程或导致细胞增殖等作用模式，在一些雌激素相关恶性肿瘤的发生发展中可能起一定作用［1］。目前在子宫内膜、胎盘、心脏、乳腺、神经、卵巢、骨组织及前列腺中均发现GPR30。Smith等［2］报道在卵巢癌和子宫内膜癌中GPR30有所表达，认为其可作为预测患者预后的依据。有研究发现GPR30不仅在大鼠子宫肌层中表达，且在剖宫产术中的肌层组织中也检测到［3］。本文探讨GPR30与子宫肌瘤发生的相关性。

1 材料和方法

1.1 标本收集 收集2015年1月至6月宁波大学医学院附属医院妇科行手术切除的子宫肌瘤组织及瘤旁子宫平滑肌组织标本30对。患者中位年龄39岁（35～46岁），月经周期规则。标本经病理证实为子宫平滑肌瘤及增生期内膜。所有患者均知情同意并签署知情同意书。排除合并有子宫内膜异位症、恶性肿瘤、盆腔炎症性疾病及结缔组织疾病的患者。术前至少3个月内未接受过任何性激素类药物治疗。

1.2 方法 （1）免疫组织化学染色：采用卵白素标记碱性磷酸酶方法检测GPR30蛋白在子宫肌瘤及瘤旁正常子宫平滑肌组织。使用的一抗为GPR30兔多抗（稀释比为1∶300），购自北京博奥森公司；二抗为北京中衫金桥公司试剂盒中抗体（1∶100，试剂盒货号为：SP-9000）。检测按免疫组化试剂盒内说明书进行，步骤如下：常规石蜡标本3～4 μm连续切片，常规脱蜡、水化，枸橼酸盐缓冲液高温、高压抗原修复，3%过氧化氢钝化内源性过氧化物酶活性，加山羊血清封闭后加入一抗，4℃冰箱过夜后加二抗。滴加适量的辣根酶标记链酶卵白素，常规二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。（2）总蛋白质提取及Western blot分析：①总蛋白质提取及定量：将切碎的冰冻组织放入适量蛋白提取液中（每100mg组织使用1ml RIPA蛋白裂解液，临用时加入罗氏公司蛋白酶抑制剂）高速匀浆，12000g离心5min后，上清液分装至EP管中-20℃冻存，取4μl用于BCA蛋白定量分析，具体参照上海生工生物公司BCA试剂盒说明书。使用时加入蛋白上样缓冲液于100℃变性5min后上样。②Western blot：制备12%SDS-PAGE凝胶，每泳道加样量为30μg总蛋白质，200v恒压电泳1～2h后，分离凝胶将蛋白转印至PVDF膜上（Millipore公司，Immobilon®-P），200mA恒流冰浴电转1.5h。脱脂牛奶封闭后加入一抗（2μg/ml）4℃封闭过夜，PBST漂洗后加入HRP标记二抗（1/4～5000）室温孵育1h。充分洗涤后使用ECL显影（参照ECL试剂盒说明书进行）。得到的X线胶片扫描后用ImageJ软件分析条带的光密度数值。以GAPDH作内参照进行定量数据处理。（3）实时荧光定量逆转录-PCR：①以GPR30基因CDS序列为扩增目标序列，为了保证扩增特异性DNA，所有引物设计扩过内含子区域。经NCBI blast验证其特异性。引物由上海生工生物工程公司合成。选用GAPDH作内参照用于确保实验准确性和后期定量分析。用于检测GPR 30mRNA表达水平的上下游引物序列分别为：5'-GGGCCACGTCATGTCTCTAA-3'，以 及：5'-CTGGTCGACGGTGTCAGAAA-3'， 产 物大小为270bp。作为内参用的GAPDH上下游引物分 别 为：5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'以 及5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'，产物大小为168bp，横跨3号和4号外显子。②总RNA提取及cDNA合成：用Invitrogen公司的Trizol试剂从冰冻组织中提取总RNA，RNA浓度用分光广度计测量后取1μg RNA按上海生工逆转录试剂盒合成cDNA。循环条件是：42℃15min；99℃5min。③实时荧光定量逆转录-PCR：相对实时荧光定量PCR根据Eco实时荧光定量PCR的指导手册完成。每孔总体积为25μl，其中含有12.5μl 2×SybrGreen Master Mix试剂混合液，0.375μl稀释荧光带，上、下游引物分别为1μl（150nM），8μlDEPC水及2.5μl cDNA。相对实时荧光定量PCR扩增效率根据△CT值计算，在90%～110%范围内被认为有效。用DEPC水作为阴性对照。用熔解曲线来监测实验结果是否有引物二聚体产生。循环体系为：95℃30s；55℃60s；72℃60s。熔解曲线条件为55℃～95℃。用琼脂糖凝胶电泳进一步确认PCR产物扩增片段。GPR30基因相对表达率根据Pfaff方法计算，采用正常子宫平滑肌组织cDNA做为标准值（Calibrator）。采用HPRT-1基因作为内参照（GAPDH基因作为内参照得到同样结果）。平均CT值转换成倍数关系进行图表分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS Windows 18.1统计软件。计量资料以（x±s）表示，用配对t检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色 结果显示GPR30蛋白在子宫肌瘤及瘤旁正常子宫肌组织中均有较丰富的表达。GPR30主要分布在胞浆内（见图1）。

图1 GPR30在子宫肌瘤和瘤旁肌层组织中的免疫组化染色

2.2 Western blot GPR30蛋白的表达在增生期的子宫肌瘤组织中的表达均明显高于瘤旁正常子宫平滑肌层组织（子宫肌瘤组：2.69±1.06；正常肌层组：1.76±0.85，P＜0.05）（见图 2）。

2.3 实时荧光定量PCR 结果显示GPR30 mRNA的表达在增生期的子宫肌瘤细胞中的表达均明显高于瘤旁正常子宫肌细胞（P＜0.01）（见图3）。

图3 GPR30 mRNA在肌瘤和瘤旁肌层组织中的表达

3 讨论

3.1 GPR30的由来和定位 上世纪90年代，Cameci等［4］发现G蛋白偶联受体30（GPR30），其有别于传统雌激素受体，在2008年正式被命名为G蛋白偶联雌激素受体（GPER）。以往认为作为GPR30只在细胞膜上表达，然而越来越多的研究认为GPR30主要分布于细胞的内质网上，在胞浆中也有表达。也有学者提出GPR30在雌激素刺激下可出现从胞膜到胞核的转位［5］。ERα本是核受体，但在雌激素刺激下也可在胞核与胞膜之间穿梭［5］。本研究通过免疫组化检测提示GPR30主要存在于胞浆中，而非细胞膜上。但近来有学者通过免疫组化检测提示GPR30主要存在于胞核上［6］，与本研究不一致。各实验室所用细胞特异性、功能状态和抗体不同都有可能影响实验结果。因此，还需进一步研究确定GPR30的具体亚细胞定位。

3.2 GPR30在组织中的表达 Beth［7］等发现子宫内膜异位症的在位及异位内膜中GPR30的表达均高于正常内膜组织。正常内膜中GPR30表达受雌孕激素周期性调节影响，但在子宫内膜异位症中的在位及异位内膜中表达却是失控的。也有研究发现在人类的内膜及早孕期蜕膜组织中GPR30的表达在分泌期低于增殖期，尤其低于早孕期蜕膜，表达模式可能受卵巢激素的调节［8］。在乳腺癌、子宫内膜癌细胞中发现GPR30呈高表达，提示其可能与疾病的发生有关。GPR30还可能参与孕期人类子宫肌层的生理活动，在老鼠的子宫肌层中也检测到GPR30 mRNA。结合本试验，作者推测GPR30在子宫肌瘤细胞的局部高表达与子宫肌瘤的发生可能有相关性。作者发现在子宫肌瘤及瘤旁子宫平滑肌层组织中GPR30均有表达。通过检测GPR30 mRNA及其蛋白水平，发现在增生期的子宫肌瘤组织中GPR30表达均明显高于瘤旁子宫平滑肌组织。子宫肌瘤并非弥漫性病变，可能与局部高水平雌激素有关，其与GPR30高表达也有一定相关性。

3.3 GPR30可能参与的信号通路 选择性雌激素受体调节剂（SERM）他莫昔芬及其代谢产物4羟基他莫昔芬和纯抗雌激素药物氟维司群（ICI182780）都能与GPR30结合。这些合成的抗雌激素药物是雌激素核受体α完全或不完全的拮抗剂，却是GPR30的激动剂，这可能与上述药物的耐药性有关。Vivacqua等［7］发现在甲状腺癌及子宫内膜癌细胞系中4羟他莫昔芬拮抗ERα活性，但同时又可通过GPR30来诱导c-fos表达和细胞增殖，这或许可以解释乳腺癌内分泌治疗增加子宫内膜增生和癌变风险的现象。GPR30能与雌二醇或环境雌激素特异性结合，且又不受经典雌激素拮抗剂阻断。通过酶和细胞膜离子通道相关的细胞膜上雌激素受体激活，经GPR30介导的快速传输途径，被称为“非基因组”信号途径［9］。与雌激素类物质结合的GPR30快速激活细胞内的第二信号系统，包括胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）的激活、钙离子动员和环磷酸腺苷（cAMP）的产生等，间接调解产生一系列基因转录反应，在细胞中发挥多种类型生物学效应［10］。这是一个错综复杂的信号转导网络，不仅在每条通路上有许多精细的调节，而且各通路之间也存在着极其复杂的相互联系。故可以进一步探索GPR30在子宫肌瘤细胞上的雌激素信号传导机制，在通路中寻找抑制肌瘤细胞周期活动和增殖的位点，为研究子宫肌瘤的治疗和预防寻找新靶点。本资料提示：在子宫平滑肌组织及子宫肌瘤组织中均检测到GPR30，且二者有明显的表达差异。因此，可以认为针对GPR30表达呈阳性的子宫肌瘤患者辅助应用相应拮抗剂，可能有助于提高子宫肌瘤治疗的效果及预防复发，为该疾病的治疗带来新的机遇。