中国被毛孢高产孢菌株的筛选

王锦锋, 王 忠, 吴鸿雪

(安发福建生物科技有限公司/福建省天然生物活性物质企业重点实验室，福建 宁德 352000)

冬虫夏草(Cordycepssinensis)是我国传统的名贵珍惜药材，与人参、鹿茸并称为我国三大补品，是由冬虫夏草菌[Ophiocordycepssinensis(Berk)]侵染蝙蝠蛾幼虫而形成的虫菌复合体，在我国有着悠久的药食用历史[1-3]。1989年刘锡琎等[4]首次报道了中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，2005年被认定为冬虫夏草无性型[5-8]。目前中国被毛孢的相关研究主要集中在培养、培养基筛选、发酵工艺以及化学成分等方面，而关于不同产地或近似种之间的比较筛选以及优良菌株筛选的研究尚少[9-14]。利用中国被毛孢进行生产的国内企业仅中美华东制药等少数几家[15-16]。随着市场对冬虫夏草需求量的扩大，研究和发掘优良的中国被毛孢菌株，对中国被毛孢产业后期的基础研究和开发生产具有重要意义[17]。本研究采用不同培养基和培养方法对5株中国被毛孢菌株进行了比较，主要考察产孢量，并结合考虑菌丝生长速度、菌落平均半径、菌落形态及菌丝生物量等性状表现，以期筛选出产孢量高、生物性状良好的菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 5个供试菌株编号为：620-1、620-2、7B、8B和530，均由安发(福建)生物科技有限公司菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基 (1)固体培养基，采用试管和平板进行培养。①常规PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，定容至1 000 mL。②加富PDA培养基：即在常规PDA培养基的基础上，添加酵母粉10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.25 g，定容至1 000 mL。(2)液体培养基，采用三角瓶进行培养。液体培养基配方：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，纯牛奶200 mL(或奶粉20 g)，超纯水定容至1 000 mL。葡萄糖、琼脂、酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和NaCl均为分析纯，奶粉为市售包装低脂奶粉。

1.1.3 仪器 SPX-250BSH生化培养箱(新苗有限公司)；BSD-YX-2400摇床培养箱(上海精宏科学仪器有限公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；XW-80A微型漩涡仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。其他仪器为一般常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 将5株中国被毛孢菌株用常规PDA培养基活化后，分别转接至装有常规PDA培养基和加富PDA培养基的试管中，置于16 ℃恒温培养箱中黑暗培养。

1.2.2 固体培养 (1)菌丝生长速度测量和菌落形态观察。使用打孔器取边缘长势一致的菌块，分别接种至装有常规PDA和加富PDA的平板培养基中央，然后置于16 ℃恒温培养箱中培养30 d。采用三角法(即由中心点向外画3条线，每2条线之间的夹角为120°)测量菌落平均半径。每7天观察1次菌落形态，并测定菌丝平均生长速度。每个处理重复3次。(2)菌丝干重测量。将待测菌丝(试管和平板)放入热水中，使培养基受热溶解后取出菌落(菌丝)放入培养皿中，置于恒温干燥箱中烘干至恒重，之后进行称量。每个处理重复3次。

1.2.3 液体培养 使用打孔器取边缘长势相同的菌块，接种至装有100 mL培养液的250 mL三角瓶中，每瓶接种4粒，置于16 ℃、120 r·min-1的震荡培养箱中黑暗培养。3次重复。

1.2.4 分生孢子收集及计数 (1)固体培养。吸取0.5 mL·L-1的吐温80溶液10 mL注入待测试管中，使用漩涡仪进行充分震荡。取混合液，使用中速滤纸进行过滤。(2)液体培养。使用移液枪直接吸取菌液进行过滤。将收集的分生孢子液稀释后，使用血球计数板在显微镜下计算分生孢子数。

1.3 数据处理

应用SPSS 20.0软件和Excel软件进行数据处理及图表制作。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长速度的比较

供试菌株在平板培养基上从复苏至生长90 d的日均生长速度见图1。由图1可看出，菌株在加富PDA培养基上的生长速度均高于常规PDA培养基。在常规PDA培养基中，除了菌株8B外，各菌株无显著差异(P>0.05)，菌株8B与其他4个菌株之间均存在显著差异(P<0.05)；在加富PDA培养基中，菌株620-1生长速度最快、7B最慢，菌株620-1、620-2和530之间无显著差异，菌株7B和8B也无显著差异，但菌株620-1、620-2和530与7B、8B之间则存在显著差异。综上来看，菌株620-1、620-2和530的生长速度优于菌株7B、8B。

供试菌株在平板培养基上菌丝生长前期(0～45 d)、后期(46～90 d)的生长速度变化见表1。由表1可见，各菌株前期生长速度均大于后期，这种现象符合菌丝生长特性，其中620-1最明显。而菌株7B、8B前后期生长速度几乎无变化，说明其生长速度不会随着营养的减少而改变。

2.2 菌落形态与半径比较

2.2.1 菌落形态 5个菌株在固体培养基上培养140 d的菌落形态见图2，生长性状表现见表2。(1)加富PDA培养基上生长的菌落均比较规则，呈圆形；菌丝呈白色或些许淡黄色。其中，菌株620-1和620-2在培养后期菌落边缘有一圈土黄色菌丝，但前期并没有，可能由于后期老化而导致。菌株7B、8B的菌丝较浓密，620-1、620-2和530则较稀疏。(2)常规PDA培养基上生长的菌落较不规则，其中菌株620-1、620-2和530菌丝白色、较稀疏，而菌株7B、8B菌丝白色或棕黄色，较浓密；除530外，其他菌株外沿和底部均出现“黑化”现象，可能由于菌丝在生长过程中分泌了某些类似“黑色素”类的物质而造成，这一点在液体培养过程中也存在。

A.常规PDA培养基;B.加富PDA培养基。图2 中国被毛孢菌株在平板培养基上的菌落形态Figure 2 Colony morphology of H.sinensis strains on flat culture media

菌株性状常规PDA培养基加富PDA培养基620-1菌丝较疏,白色或灰白色,绒毛状,菌落较规则菌丝较疏,白色或灰白色,绒毛状,菌落规则620-2菌丝较疏,白色或灰白色,绒毛状,菌落较规则菌丝较疏,白色或灰白色,绒毛状,菌落规则7B菌丝浓密,白色或棕黄色,绒毛状,菌落不规则菌丝浓密,白色或棕黄色,绒毛状,菌落较规则8B菌丝浓密,白色或棕黄色,绒毛状,菌落不规则菌丝浓密,白色或棕黄色,绒毛状,菌落较规则530菌丝稀疏,白色,绒毛状,菌落规则菌丝较疏,白色,绒毛状,菌落规则

2.2.2 菌落半径 在培养第140天测量菌落半径(图3)。(1)常规PDA培养基。菌株530菌落半径最大，620-1次之，但两者之间无显著差异，菌株620-2、7B和8B之间也无显著差异，但与菌株530之间则存在极显著差异(P<0.01)。总体上，各菌株在常规PDA培养基上生长较平均，差异不明显。(2)加富PDA培养基。菌株530菌落半径最大，菌株7B最小，两者之间存在极显著差异，菌株7B与菌株620-2、8B间无显著差异。综上来看，各菌株在2种培养基上的生长趋势大致相同，但在加富PDA培养基上的菌落明显大于常规PDA培养基。其原因为加富培养基中的营养比常规培养基高，为菌丝生长提供了更加充分的养分。因此，菌落大小表现为：530>620-1>620-2>8B>7B。

相同培养基附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。图3 中国被毛孢菌株在平板培养基上的菌落半径比较Figure 3 Colony radius comparison of H.sinensis strains on flat culture media

2.3 菌丝生物量分析

对供试菌株进行2种培养基试管和平板培养，140 d后测定菌丝干重。

2.3.1 试管培养 5个菌株试管培养的菌丝干重见图4。(1)常规PDA培养基。各菌株菌丝干重在0.105～0.148 g之间，其中菌株620-1最大(0.148 g)、8B最小(0.105 g)。菌株8B与菌株7B、620-1、620-2之间存在极显著差异，但菌株530、7B、620-1、620-2之间无显著差异，说明各菌株在常规PDA培养基上生长较为平均，这可能与培养基本身有关系。(2)加富PDA培养基。各菌株菌丝干重在0.244～0.311 g之间，菌株530最大(0.311 g)、8B最小(0.244 g)，菌株530、7B与620-1、620-2和8B之间存在极显著差异(P<0.01)。总体上，各菌株在2种培养基上的生长情况较为平均；从菌丝生物量来看，常规PDA培养基表现为：620-1>620-2>7B>530>8B，加富PDA培养基表现为：530>7B>620-2>620-1>8B。

相同培养基附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。图4 中国被毛孢菌株在试管固体培养基中的菌丝干重比较Figure 4 Dry weight comparison of mycelia of H.sinensis strains on solid culture media in test tubes

2.3.2 平板培养 (1)常规PDA培养基。各菌株菌丝生物量在0.117～0.256 g之间，其中菌株530最大(0.256 g)、7B最小(0.117g)(图5)。菌株7B与其他菌株之间均存在极显著差异，而菌株620-1、620-2和8B之间无显著差异。说明各菌株在常规PDA培养基上生长较为平均，这与试管培养情况相似。(2)加富PDA培养基。各菌株菌丝生物量在0.200～0.488 g之间，菌株620-1最大(0.488 g)、7B最小(0.200 g)，两者间存在极显著差异。菌株7B与620-2和530之间存在极显著差异，与8B之间无显著差异；菌株8B与7B表现相似。从菌丝生物量来看，常规PDA培养基表现为：530>8B>620-2>620-1>7B，加富PDA培养基表现为：620-1>620-2>530>8B>7B。

相同培养基附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。图5 中国被毛孢菌株在平板固体培养基中的菌丝干重比较Figure 5 Dry weight comparison of mycelia of H.sinensis strains on solid culture media on culture plates

综上所述，就菌丝生物量来看，菌株620-1、620-2和530要优于菌株7B和8B。这结果与菌丝平均生长速度相一致。

2.4 产孢量分析

供试菌株在2种固体培养基以及液体培养基上培养120 d后，收集分生孢子并计数。各培养基上产孢量见表3。

表3 中国被毛孢菌株在不同培养基上的产孢量1)Table 3 Average sporulation capacity of H.sinensis strains on different culture media

1)同列数值后附不同大写字母者表示差异达0.01显著水平。

2.4.1 固体培养基平板培养 (1)常规PDA培养基。菌株8B产孢量最高(2.513 5×109个·g-1)，620-1产孢量最低(0.559 3×109个·g-1)，两者之间存在极显著差异；而菌株620-1、620-2和530之间无极显著差异。(2)加富PDA培养基。菌株8B产孢量最高(0.665 2×109个·g-1)，620-2最低(0.165 4×109个·g-1)。菌株620-2与各菌株之间均存在极显著差异。此外，除菌株620-1外，其他4个菌株在平板常规PDA培养基上的产孢量高于平板加富PDA培养基。总体上，平板常规PDA培养基产孢量表现为：8B>7B>530>620-2>620-1；平板加富PDA培养基表现为：8B>620-1>530>7B>620-2。

2.4.2 固体培养基试管培养 (1)常规PDA培养基。菌株7B产孢量最高(4.142×109个·g-1)，620-1产孢量最低(1.133×109个·g-1)，两者之间存在极显著差异；而菌株620-1与620-2之间无极显著差异，但与7B和8B之间均存在极显著差异。(2)加富PDA培养基。菌株530产孢量最高(0.536 4×109个·g-1)，7B最低(0.244 0×109个·g-1)。菌株7B与530之间存在极显著差异。此外，菌株在试管常规PDA培养基上的产孢量高于试管加富PDA培养基。总体上，试管常规PDA培养基产孢量表现为：7B>8B>530>620-2>620-1；试管加富PDA培养基表现为：530>620-2>620-1>8B>7B。

2.4.3 液体培养基培养 菌株8B产孢量最高(79.10×106个·g-1)，620-1产孢量最低(8.40×106个·g-1)，两者之间存在极显著差异；而菌株620-2和530之间无极显著差异，但与7B、8B存在极显著差异。总体上，液体培养基产孢量表现为：8B>7B>530>620-2>620-1。

3 小结

本研究中，菌块在培养中出现两方面的生长，一是在培养过程中菌块自身在“长大”，即接进去的菌块本身在膨大，且呈“瘤状”，这现象在其他菌中不常见；二是向外“扩散”，并伴随着绒毛状菌丝生长(气生菌丝)。菌株620-1、620-2和530在前期培养中主要表现在菌落的生长上，而未见绒毛状菌丝生长，菌落生长到一定程度后气生菌丝才开始生长；7B和8B则从一开始就有绒毛状菌丝生长，因此在菌落生长上比另外3个菌株要差。

综合菌丝生长速度、菌落平均半径、菌落形态及菌丝干重来看，菌株620-1、620-2和530优于菌株7B和8B；但从产孢量来看，菌株7B和8B优于另外3个菌株。本研究以筛选高产孢的优良菌株为目的，产孢量是最主要的考虑因素。在生物学性状表现差异不大的情况下，菌株7B和8B可作为后续感染蝙蝠蛾幼虫提供分生孢子的优良菌株。