隐球菌荚膜多糖GXM纯化方法的改良研究

赖锐 宋英 刘惟优 袁小亮

(1.赣南医学院，赣州341000；2.赣南医学院第一附属医院呼吸科，赣州 341000)

既往研究采用乙醇和十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 特异性沉淀法从新生隐球菌H99培养上清中分离和纯化荚膜多糖获得葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan，GXM)[1-2]。但按照此方法提取GXM存在一些不足，提取GXM所得到的混合荚膜多糖溶液(GXM和GalXM)不可避免混杂有少量隐球菌菌体，干扰后续纯化过程，且纯化GXM后期需要透析1周时间，使得GXM纯化过程费时费力，而透析后GXM溶液有可能不纯，含有少量CTAB可对小鼠脾细胞产生毒性作用。为克服以上几点不足，本研究对乙醇和CTAB特异性沉淀法进行了针对性改良，具体步骤详述如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新生隐球菌和格特隐球菌分别采用H99及R265标准株，由赣南医学院第一附属医院病原微生物实验室保存提供。真菌培养采用酵母氮源基础培养基(YNB) 。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、酵母氮基础(YNB) 购自Sigma 公司。硫酸、无水乙醇、NaCl、葡萄糖均为国产分析纯试剂。C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，由赣南医学院实验动物中心提供。BD FACSCanto II流式细胞仪(美国BD Bioscience公司)。2.4G2小鼠封闭抗体、APC anti-mouse CD3 antibody 、7-AAD(7-amino-actinomycin D)购自美国Biolegend公司。本实验方案经赣南医学院伦理学委员批准。

1.2 真菌培养

从沙氏平板上挑取H99和R265单个菌落，分别接种至250 mL 酵母氮源基础培养液(Yeast nitrogen base，YNB)中，置于摇床30℃以100 r/min摇菌培养4～5 d。增菌培养液121℃高压灭菌15 min，5000 r/min离心20 min，弃沉淀，收集上清液。

1.3 荚膜多糖的分离

于上清液中缓慢加入3倍体积(750 mL)的无水乙醇，溶液出现牛奶样白色沉淀，摇匀后置4℃过夜。次日于5000 r/min离心10 min收集沉淀，弃上清，风干沉淀。加20 mL灭菌用水溶解沉淀后形成黏稠溶液，即为GXM及GalXM多糖混合物。混合多糖溶液以50 mL注射器吸取先后通过0.8 μm及0.2 μm无菌针头式过滤器(Millipore，默克公司)，进一步去除隐球菌菌体，混合多糖液墨汁染色显微镜下观察确定隐球菌菌体完全清除。

1.4 混合多糖浓度的测定

GXM及GalXM多糖浓度采用苯酚硫酸法[1]检测：首先配制浓度为10 mg/mL的葡萄糖溶液，为绘制标准曲线: 取6个玻璃管，每管加蒸馏水1 mL和60%苯酚50 μL，按顺序每管分别相应加入浓度为10 mg/mL的葡萄糖0、5、10、20、40、80 μL，混匀。再加入2.5 mL浓硫酸(浓硫酸应直接滴入玻璃管中，不能沿管壁加入)后混匀。20 min内于450 nm测量光密度，绘制标准曲线。同时取待测样品20、40、80 μL按相同方法测量光密度值，取平均值计算混合多糖含量。

1.5 CTAB沉淀GXM

常温下20 mL的多糖溶液中加入浓度为2 mol /L的NaCl 2.23 mL，使NaCl终浓度调整为0.2 mol/L，然后缓慢加入浓度为0.3%CTAB，边加边搅拌，CTAB加入量至少为多糖含量的3倍，如50 mg多糖溶液至少应加入0.3%的CTAB 50 mL (150 mg CTAB) 。然后，缓慢加入2倍体积的0.05%CTAB，边加边搅拌，随着NaCl浓度降低，白色絮状沉淀(GXM-CTAB复合物，见图1)逐渐形成。常温过夜，GXM-CTAB复合物逐渐沉淀下来。第2天再缓慢滴入0.05%CTAB直至上清无新沉淀产生保持澄清为止，确保GXM被完全沉淀出来。5000 r/min离心10 min收集沉淀，沉淀以10%乙醇洗1遍，风干，此为CTAB-GXM复合物。然后加20 mL浓度为1 mol/L的NaCl溶解沉淀，溶解需要过夜，此时形成似甘油样黏稠溶液CTAB-GXM-NaCl。

图1 混合荚膜多糖溶液印度墨汁染色

1.6 CIA 纯化GXM

首先配制25 mL比例为24∶1氯仿：异戊醇混合液(Chlorofom: isoamyl alcohol, 24∶1 v/v；CIA)。以4 mL CIA液加入20 mL CTAB-GXM-NACL中，混匀后以5000 r/min离心6 min，混合液分为3层，澄清水相层位于上端，浑浊有机层位于下端，两层相交的界面包含少量不能溶解物质。将每10 mL水相层液体转移至50 mL的离心管中(避免吸取交界面不能溶解物质)，先后加入灭菌用水10 mL和异丙醇30 mL，-30℃过夜使GXM完全沉淀。4℃ 5000 r/min离心10 min，弃上清收集沉淀，24 h风干后以5 mL无菌1×PBS 4℃过夜溶解沉淀。以前述的苯酚硫酸法测定GXM浓度后存于-30℃备用。

1.7 流式细胞仪检测

为了解纯化的GXM对细胞的毒性作用，以GXM溶液与小鼠脾细胞共孵育后检测CD3阳性的T淋巴细胞。取C57BL/6小鼠脾脏，去除红细胞制备成脾细胞悬液。以终浓度为100 μg/mL的GXM与小鼠脾细胞(终浓度为2×105/mL)37℃ 5% CO2细胞培养箱共孵育20 h。收集孵育后的细胞，首先以2.4 G2封闭抗体在4℃孵育15 min，然后以APC anti-mouse CD3于4℃避光染色30 min。在检测前10 min加入7-AAD 1 μL，以BD FACSCanto II流式细胞仪检测CD3+的T淋巴细胞活性比值。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 传统法GXM的提取

在CTAB特异性沉淀法提取GXM过程中所得到的混合荚膜多糖溶液(GXM和GalXM)不可避免混杂有少量隐球菌菌体(见图2)，干扰后续纯化过程。甚至所纯化的H99GXM(刺激终浓度100 μg/mL)与小鼠脾细胞体外共培养20 h，可引起小鼠CD3+T淋巴细胞死亡(见图3，P3=0%)。究其原因，在提取GXM过程中由于GXM-CTAB复合物不易溶解于水(见图1)。

2.2 改良法GXM的提取

①多糖含量的测定：首先用苯酚硫酸法测量了不同含量的葡萄糖在450nm的光密度值(OD)，纵坐标为糖含量，横坐标为OD值，绘制了标准曲线(见图4)，得到了多糖含量的计算方程: Y= 4.4071X2+7.0747X-0.3399，Y代表多糖浓度(mg/mL)，X代表OD450值。H99待测样品3管，分别测其OD450值为0.082、0.111、0.168，换算浓度分别为1.08、1.00、0.97 mg /mL，取平均值为1.02 mg/mL。R265待测样品3管，分别测其OD450值为0.112、0.170、0.285，换算浓度分别为2.03、 1.98、2.03 mg/mL，取平均值为2.01 mg/mL。混合多糖溶液体积为20 mL，结果提示从H99和R265隐球菌250 mL培养上清中分别获得GXM及GalXM多糖混合物约20 mg和40 mg。②GXM含量的测定：H99和R265混合多糖经CTAB特异性沉淀GXM，再使用异丙醇沉淀CTAB-GXM溶液中的GXM，最终获得GXM溶液5 mL，同样取3管(20 μL、40 μL、80 μL样品)使用苯酚硫酸法测量它们的浓度。H99GXM的浓度分别为1.43、1.61、1.65 mg/mL，取平均值为1.56 mg/mL，获得了约7.8 mg的H99GXM。R265GXM的浓度分别为3.78、3.61、3.52 mg/mL，取平均值为3.63 mg/mL，获得了约18 mg的R265GXM。H99GXM和R265GXM获得率(GXM/GXM和GalXM混合多糖)分别为39% (7.8/20) 和45% (18/40)。③改良方法纯化的GXM对细胞的毒性作用：通过流式细胞仪检测以改良法所获得的H99GXM(刺激终浓度100 μg/mL)与小鼠脾细胞体外共培养20 h后小鼠CD3+T淋巴细胞活性比值，结果提示小鼠CD3+T淋巴细胞大部分存活(见图5，P3=99.7%)。

3 讨 论

荚膜多糖在隐球菌逃逸机体的免疫杀灭过程中发挥了重要作用，且GXM也可诱导人体免疫细胞产生炎性细胞因子TNF-α 和IFN-γ促进机体清除[4]。因此有关GXM的生物学功能尚有争议，需要进一步研究[5-6]。而如何便捷地分离和纯化GXM是进一步研究它的生物学功能的前提条件。

根据Cherniak[2]和Wozniak[1]的提取方法，在提取GXM过程中所得到的GXM及GalXM混合荚膜多糖溶液不可避免混杂有少量隐球菌菌体。为此，我们使用0.8 μm及0.2 μm无菌针头式过滤器先后过滤该混合荚膜多糖溶液，从而完全去除隐球菌菌体避免它对GXM纯化后期过程的干扰。

由于GXM-CTAB复合物不易溶解于水，传统GXM提取方法后期至少需要透析1周时间，使得GXM整个纯化过程需耗时2周。本方法以24∶1氯仿：异戊醇混合液分离GXM-CTAB复合物，利用CTAB易溶于异戊醇有机溶剂中，而GXM易溶于水，离心分层后GXM位于水相、CTAB处于有机相使GXM-CTAB复合物快速分离。最后加入3倍体积的异丙醇沉淀出GXM。本研究以24∶1氯仿：异戊醇混合液替代透析法来分离GXM-CTAB复合物，这一改良步骤目前国内外研究均未见报道。此外，由于改良的纯化方法避免了透析1周这一费时步骤，整个提取过程耗时从原来的14 d缩短为8 d。

H99GXM和R265GXM获得率分别为39% (7.8/20)和45% (18/40)，由此推算从每升H99和R265菌株培养上清液中可分别获得31 mg和72 mg GXM，获得率与国内外学者李平[3]和Cherniak[2]报道相一致。这表明本研究采用的GXM改良纯化法与传统方法的提取效率相当。而且，以改良法所获得的H99GXM(刺激终浓度100 μg/mL)与小鼠脾细胞体外共培养20 h，并没有引起小鼠CD3+T淋巴细胞调亡。

图2混合荚膜多糖溶液印度墨汁染色图3传统方法提取的GXM刺激小鼠脾细胞。a.流式细胞散点图；b.7-aminoactinomycin D (7-AAD)染色;c.APC-CD3染色(P1.T淋巴细胞;P2. alive 7-AAD stained cells;P3.CD3阳性T淋巴细胞)图4葡萄糖浓度(Y)与OD450值(X)标准曲线(苯酚硫酸法)图5改良法提取的GXM刺激小鼠脾细胞。a.流式细胞散点图;b.7-aminoactinomycin D (7-AAD)染色;c.APC-CD3染色(P1.T淋巴细胞;P2.alive 7-AAD stained cells;P3.CD3阳性T淋巴细胞)

Fig.2Mixed capsular polysaccharide solutionwith India ink stainingFig.3Stimulation of mouse splenocytes using GXM extracted by traditional methodFig.4Standard curve of glucose concentration (Y) and OD450value (X) made by phenol sulfuric acid methodFig.5Stimulation of mouse splenocytes using GXM extracted by modified method

本研究采用的GXM改良纯化法不仅与传统方法的提取效率相当，而且使提取过程更佳简单，耗时减少。由于本研究属于探索式研究，所以存在样本量较少，且通过流式细胞学检测不足以了解GXM对细胞的毒性作用，所以我们接下来将通过动物体内实验以了解GXM对细胞的毒性作用。