罗米地辛对氟康唑体外抗白念珠菌影响的研究

蔡晴 杨连娟 高志琴 任弘瑾 杨虹 谭静文

(上海市皮肤病医院真菌病科，上海 200050)

侵袭性念珠菌感染的发病率逐年增高，白念珠菌的耐药现象也日趋严峻[1]，寻找合理、有效的治疗手段是临床中亟需解决的问题。有学者提出，染色体的修饰异常可介导肿瘤细胞的可逆性耐药，白念珠菌的耐药机制与肿瘤细胞有类似之处，如外排泵功能的活跃[2-3]。有个别研究提示组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂可增加白念珠菌对三唑类药物的敏感性[4-5]。罗米地辛是一种双环肽类的HDAC抑制剂，美国FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。本研究以Rpd3选择性抑制剂罗米地辛为研究对象，观察其对氟康唑抗白念珠菌活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

白念珠菌标准株4株(ATCC 90028，ATCC 64550，ATCC 62342，ATCC 44505，由中国医学科学院皮肤病医院医学微生物菌(毒)种保藏管理中心真菌中心惠赠，我院门诊收集白念珠菌临床株11株(C2、C7、C9、C14、C15、C54、C63、C66、C73、N168、N175)，均经科玛嘉显色培养基及ITS序列分子鉴定。质控株为克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2 试验药物

氟康唑药粉(批号：S1331，纯度>99%)，用灭菌蒸馏水配置成1280μg/mL。HDAC抑制剂Rpd3选择性抑制剂：罗米地辛溶液(批号:S3020，浓度10 mmol/L)。以上药物均购自Selleck公司，放置于-20℃保存备用。

1.3 氟康唑对白念珠菌的体外敏感性检测

参考CLSI的M27-A3方案[6]配制RPMI 1640培养基及药液。氟康唑在96孔板上第1～10列药物浓度范围为64～0.125 μg/mL。将药物的原液稀释至2倍受试终浓度，取100μL药液加入受试孔，第11列及第12列加入不含药的RPMI 1640培养基，作为生长对照孔及空白对照孔。通过麦氏比浊仪调整受试菌接种终浓度约为1×103CFU/mL，加入含有药液的平板，置于35℃培养箱孵育48 h。分别记录MIC值(肉眼观察与生长孔比较抑制50%生长程度的药物浓度)和拖尾程度(48 h时无菌生长孔的药物浓度)，并用酶标仪检测OD630nm的吸光值。上述检测均平行三孔，隔日重复两次。

1.4 罗米地辛对氟康唑抗白念珠菌活性的影响

前期预实验发现，罗米地辛单独作用没有抗白念珠菌活性，通过棋盘法筛选出两个浓度分析罗米地辛对氟康唑抗白念珠菌活性的影响。96孔板中第1列至第10列氟康唑浓度为64～0.125 μg/mL(50 μL)，并在不同的板中分别加入2 μg/mL和4 μg/mL的罗米地辛(50μL)，第11列及第12列分别作为生长对照和空白对照。加入受试菌菌液，置于35℃培养箱孵育48 h。分别记录MIC值和拖尾程度，并用酶标仪检测吸光值。上述检测均平行3孔，隔日重复2次。

1.5 统计分析

采用SPSS 21.0软件，将MIC值换算为对数进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 受试菌株体外抗真菌药物敏感性

各受试白念珠菌菌株对氟康唑的体外敏感性见表1。参考CLSI的M27-S4折点[7]，受试菌株中氟康唑敏感株、剂量依赖株、耐药株各5株，MIC范围在0.25～32 μg/mL。

2.2 罗米地辛对氟康唑抗白念珠菌活性的影响

罗米地辛可以增加氟康唑的抗真菌作用：加入2 μg/mL的罗米地辛后，2株受试菌MIC值降低，加入4 μg/mL的罗米地辛后，8株受试菌MIC值降低。两组MIC值与单用氟康唑分别比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 氟康唑及氟康唑联合罗米地辛对白念珠菌的体外抗真菌药物敏感性

罗米地辛可以减少氟康唑的拖尾现象：计算48 h无菌生长孔药物浓度与24 h MIC值的比值，比值越高代表拖尾现象越明显。将结果做热点图进行分析，可以观察到加入罗米地辛后，受试菌株中8株比值明显减低，说明罗米地辛减少了氟康唑的拖尾现象。见图1。

图1罗米地辛对氟康唑抗白念珠菌拖尾现象的影响。抑制拖尾现象通过计算：48 h无菌生长孔药物浓度与24 h MIC值的比值，将比值做热点图。加入罗米地辛后，48h时受试白念珠菌的拖尾现象明显减少

Fig.1Effects of romidepsin on trailing growth with fluconazole. The inhibition of trailing growth was evaluated by the ratio of the highest concentration with no sign of growth at 48 h to the MIC value at 24 h. The addition of romidepsin reduced the trailing growth of C.albicans strains at 48h

罗米地辛可以减少测试孔菌量：以敏感株ATCC 44505、剂量依赖株C7和耐药株C63作为代表菌株进行分析，其吸光度的折线图表明，与单独用氟康唑比较，高浓度药物孔加入罗米地辛后可以明显减少测试孔菌量，罗米地辛增加了氟康唑的抑菌活性。见图2。

3 讨 论

目前，表观遗传学的相关研究在肿瘤性疾病、免疫相关疾病中已广泛开展，医学真菌方面报道相对较少。对于白念珠菌，乙酰化修饰较甲基化修饰的作用更为重要[8]。组蛋白的乙酰化修饰与两种酶密切相关，组蛋白乙酰基转移酶和HDAC。通过影响组蛋白及非组蛋白乙酰化的过程，HDAC在基因表达调控方面具有极为重要的作用，被视为是环境信号与细胞基因调控网络之间的中枢接点[9]。HDAC可以将乙酰基从组蛋白H3、H4的N末端赖氨酸残基上移去，使染色质结构变得相对致密，转录调控因子不易接近DNA，从而抑制基因的表达。研究发现，HDAC抑制剂具有抗肿瘤的作用，并已应用于临床，如美国上市的伏立诺他、罗米地辛及我国的西达本胺[10-11]。基于多药耐药机制的相似性(如肿瘤细胞耐药和真菌耐药均与外排泵的过度表达相关)，并随着白念珠菌表观遗传学研究的不断深入，研究发现组蛋白去乙酰化修饰与白念珠菌的表型、毒力、体外敏感性及耐药性均有一定相关性[4,5,12]。

图248 h时罗米地辛对氟康唑抗白念珠菌菌量生长的影响。a. ATCC 44505;b. C7;c. C63。△：氟康唑组吸光度，○：氟康唑加2 μg/mL罗米地辛吸光度，□：氟康唑加4 μg/mL罗米地辛吸光度

Fig.2Effects of romidepsin on fluconazole activities and growth ofC.albicansstrains at 48h. a. ATCC 44505; b. C7; c. C63. △: absorbance of fluconazole, ○: absorbance of fluconazole with 2μg/mL romidepsin, □: absorbance of fluconazole with 4μg/mL romidepsin

罗米地辛是由紫色色杆菌提取合成的一种缩酚酸肽类天然产物，属于双环肽类的HDAC抑制剂，现被美国FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和外周T细胞淋巴瘤(PCTL)[13-14]。对于酵母菌，HDAC主要分为3类，Ⅰ类以Rpd3为代表，Ⅱ类以Hda1为代表，Ⅲ类以Sir2为代表。罗米地辛是一种Rpd3选择性抑制剂，主要抑制Ⅰ类HDAC，包括HDAC1和HDAC2[15]。前期研究发现，曲古菌素a对唑类药物的抗真菌活性有增效作用，但是该药仅能作为试验用药，且是非选择性的HDAC抑制剂[5]。相对于曲古菌素a，罗米地辛更具有靶向性，且已经在临床中应用，更具有研究和实用价值。本研究发现罗米地辛对氟康唑的体外活性有增效作用，主要表现在MIC值降低、菌量减少和抑制拖尾现象，对敏感株、剂量依赖株和耐药株均有一定作用，目前国内外尚未见报道。

研究发现，组蛋白去乙酰化修饰与白念珠菌的体内外获得性氟康唑耐药密切相关[5]。组蛋白去乙酰化修饰作为上游机制对白念珠菌的唑类药物获得性耐药有调节作用。组蛋白去乙酰化修饰可在获得性氟康唑耐药形成早期通过对白念珠菌外排泵的调控来诱导耐药形成：耐药形成过程中，HDA1和RPD3表达水平均在早中期升高，稳定耐药形成后降低，而CDR1和CDR2表达水平变化与其同向。由于组蛋白去乙酰化可使被修饰的DNA或染色质空间构型更为紧密，抑制基因的表达，鉴于此，我们推测组蛋白去乙酰化修饰并不是直接作用于外排泵基因，中间可能涉及多个通路、转录因子，其相关机制有待进一步研究。

综上所述，罗米地辛作为Rpd3选择性抑制剂对氟康唑抗白念珠菌活性有增效作用，对其深入研究有助于我们进一步阐明白念珠菌耐药的发生机制以及寻找新的药物靶点均有重要意义。

致谢：感谢中国医学科学院皮肤病医院真菌科刘维达教授对本文提供的帮助！