三相萃取黄参蛋白质及其抗氧化性分析

张喜峰，程雯慧，张春梅*

（1.河西学院 农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000）

黄参（Sphallerocarpusgracilis）为多年生伞形科迷果芹属植物，在国内主要分布于新疆、甘肃等西北地区，具有食用历史较长、营养成分丰富等特点，其中多糖、蛋白质含量较高，与世界卫生组织推荐的参照蛋白模式基本吻合，属于优质蛋白质；应用前景广阔[1]；目前，国内外研究主要集中在黄参多糖、多酚和黄参食品开发等方面[2-5]；而有关黄参蛋白质（Sphallerocarpus gracilis protein，SGP）的应用研究相对较少；蛋白质采用初级分离盐析沉淀后，采用柱层析进行后续纯化步骤，虽纯度高，但步骤繁琐，周期较长，不利于工业化生产[6]。

三相萃取（three phase-partitioning extraction，TPPE）是基于一种液-固-液形成三相基础上非色谱分离技术，具有简单、快速、成本低、回收率高等特点[7]；其主要由一定量无机盐（通常为硫酸铵）、蛋白质粗提液和小分子亲水性有机溶剂（通常为叔丁醇）充分混合，静置一段时间后，即可形成多酚类成分主要富集在上相即叔丁醇相，中间相为分离的蛋白质，下相主要为多糖和其他亲水物质；三相的形成与盐的浓度、表面张力和渗透作用密切相关[8]。罗磊等[9]采用叔丁醇/硫酸铵三相体系萃取金银花过氧化物酶，并对其酶学性质进行了分析；GAGAOUA M等[10]采用三相萃取分离甜瓜汁中甜瓜蛋白酶，获得了最佳萃取条件；AVHADDN等[11]对纤溶酶超声辅助三相萃取条件进行了优化；其温和的分离环境在天然产物活性成分分离和纯化过程中具有重要作用，已广泛应用于金属、油脂、酶等有效成分的分离[12-14]。

本研究拟对黄参中蛋白质进行三相萃取研究，通过单因素和正交试验优化其萃取条件，采1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除率、铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidantpower，FRAP）值和氧自由基吸收能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）对黄参中蛋白组分抗氧化性进行研究，以期为黄参中蛋白质的深度开发和工业化生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄参：采自甘肃山丹县，经张春梅副教授鉴定为迷果芹属（Sphallerocarpus）伞形目伞形属；经清洗、阴干、粉碎后过60目筛，低温保存备用。叔丁醇、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；维生素C（vitamin C，VC）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DFY-1000C小型粉碎机：温岭市林大机械有限公司；恒温磁力搅拌器；陕西环宇仪器设备公司；PHS-25/25C精密台式pH计；辽宁赛亚斯科技有限公司；L6S紫外可见分光光度计；上海重逢科学仪器有限公司；GDXL-16D低速低温离心机：常州市凯航仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄参蛋白质提取液制备

称取一定量黄参粉末按照料液比1∶50（g∶m L）加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7），在25℃振荡处理30m in后，在4 000 r/min离心10m in，上清液为黄参蛋白质提取液。

1.3.2 黄参蛋白质三相萃取技术

取100m L已制备的黄参蛋白质提取液，加入固体硫酸铵使其饱和度为20%～60%，采用1mol/LHCl或1mol/L NaOH调节体系pH为3.5～5.5，按照提取液∶叔丁醇体积比（1.0∶0.1～1.0∶2.5）加入一定量的叔丁醇后，充分混匀，在20～40℃水浴处理15～35m in，在4 000 r/m in离心10m in，收集含黄参蛋白质的中间相，经冷冻干燥（-45℃干燥24 h，真空度10 Pa）后得黄参蛋白质组分，命名为SGP-1。

1.3.3 传统盐析沉淀黄参蛋白质

取100m L已制备的黄参蛋白质提取液，加入31.3 g固体硫酸铵，对其进行分级沉淀，经离心、透析除盐、冷冻干燥（-45℃干燥24 h，真空度10 Pa）得黄参蛋白质组分，命名为SGP-2。

1.3.4 黄参蛋白质含量测定及提取率计算

采用凯氏定氮法测定黄参蛋白质含量[15]，蛋白质提取率计算公式如下：

1.3.5 黄参蛋白质体外抗氧化活性测定

（1）DPPH·清除能力测定

SRP-1、SRP-2的抗氧化性测定参考文献DPPH自由基清除法[16]，略作修改；分别取不同质量浓度（0.2～1.0mg/mL）SGP-1和SGP-2各2m L，加入0.2mmol/LDPPH溶液2.0m L，在室温避光反应30min后在波长519 nm处测定其吸光度值，以VC为阳性对照，DPPH·清除率计算公式如下：

（2）ABTS+自由基清除能力测定

参照文献[17]方法略作改动：将4.9mmol/L过硫酸钾和7mmol/L ABTS+溶液等体积混合后，室温避光反应12 h后，采用0.45μm有机相针式滤器对青绿色ABTS+溶液进行过滤后，采用甲醇稀释，其波长734 nm处的吸光度值为0.70±0.02。分别取不同质量浓度（0.2～1.0mg/m L）SRP-1和SRP-2各150μL，加入ABTS+溶液2.85m L，混合均匀，室温反应2 h后，在波长734 nm处测定其吸光度值，VC为阳性对照，ABTS+自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为不含样品吸光度值；A1为含样品和ABTS+吸光度值；A2为不含ABTS+样品吸光度值。

（3）还原力的测定

按照VASCO C等[18]文献，测定样品FRAP值。取不同质量浓度（0.2～1.0mg/m L）SRP-1和SRP-2各150m L，均加入4.5m LFRAP工作液，在37℃加热反应40m in，在波长593 nm处测定其吸光度值，根据吸光度值，求得FeSO4相应浓度，定义为FRAP值。

（4）抗氧化能力指数的测定

参照文献[19]方法测定ORAC值（抗氧化能力指数），ORAC值以Trolox当量（Troloxequivalent，TE）（μmolTE/mg）表示。

3×0+8+3×9+6+3×0+0+3×1+2+3×4+5+3×6=8+27+3+6+2+12+5+18=81，于是在这个加权和的方式下，若想让UPC的每位数字和被10整除，则校验码应为9，即81+9=90被10整除．因此，正确的UPC应是 0 8 9 6 0 0 1 2 4 5 6 9．

1.3.5 数据处理

所有试验均重复3次，数据以平均值±标准差形式表示；数据采用Origin2016软件作图。

2 结果与分析

2.1 三相萃取单因素试验

2.1.1 硫酸铵饱和度对黄参蛋白分离效果的影响

蛋白质盐析效果不仅与盐的种类有关，而且与盐的浓度密切相关。硫酸铵饱和度是影响三相萃取体系主要因素之一；不同饱和度条件下三相体系对黄参蛋白质分离具有不同提取效果。固定黄参蛋白粗提液与叔丁醇体积比为1.0∶1.0，改变硫酸铵饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%，研究硫酸铵饱和度对黄参蛋白质三相萃取效果的影响，结果见图1。

图1 硫酸铵饱和度对黄参蛋白质三相萃取效果的影响Fig.1 Effect of ammonium sulfate saturation on three phasepartitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

硫酸铵的盐析作用可有效促进蛋白质发生沉淀作用；NH4+和SO42-由于霍夫密斯特效应在蛋白质、酶等生物大分子的分子间相互作用的两端具有重要作用。叔丁醇与蛋白质粗提液互溶，一定量硫酸铵加入溶解后，出现明显分层现象；即上相为叔丁醇相，下相主要含盐，盐析作用结果出现中间蛋白质沉淀固体相，形成液-固-液三相体系。由图1可知，随着硫酸铵饱和度逐渐增加，黄参蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势，当饱和度为50%时，提取率达到最大值；与其他梯度下硫酸铵饱和度相比，其提取率差异显著（P＜0.05）；继续增加饱和度，蛋白质提取率逐渐下降；原因可能是硫酸铵在低饱和时，硫酸铵与叔丁醇协同效果较弱，导致部分蛋白质停留在下相；当饱和度过高时，可能促使其他杂蛋白被沉淀于中间相，影响其提取效果。因此，确定硫酸铵饱和度为50%。

2.1.2 叔丁醇加入量对黄参蛋白分离效果的影响

叔丁醇与其他醇类有机溶剂相比，是一种独特一元醇，不仅具有溶解非极性成分外，还有醇沉和浮选剂作用，与一定量硫酸铵协同作用可有效纯化目标产物。本试验中，固定硫酸铵饱和度为50%，改变蛋白质提取液与叔丁醇体积比分别为1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5，分析叔丁醇加入量对黄参蛋白分离效果的影响，结果见图2。

图2 叔丁醇加入量对黄参蛋白质三相萃取效果的影响Fig.2 Effect of tert-butanoladdition on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

由图2可知，当蛋白质提取液和叔丁醇体积比在1.0∶0.5～1.0∶1.0范围内时，黄参蛋白质提取率逐渐增加，当蛋白质提取液和叔丁醇体积比为1.0∶1.0时，提取率达到最大值，为（86.51±0.21）%；与蛋白质提取液和叔丁醇体积比1.0∶0.5相比，提取率差异显著（P＜0.05）；当上述二者体积比在1.0∶1.0～1∶2.5内，提取率之间差异均不显著（P＞0.05）；叔丁醇加入量较小时，其与硫酸铵协同效果较弱，导致黄参蛋白质沉淀效果较差；当叔丁醇加入量过高时，蛋白质提取率趋于稳定，基本不变。因此，从节约成本角度考虑，确定蛋白质提取液和叔丁醇体积比为1.0∶1.0。

2.1.3 体系pH对黄参蛋白分离效果的影响

目标蛋白的带电情况在一定意义上决定了盐析作用效果，目标蛋白所带静电荷主要是由体系pH决定的，在确定叔丁醇加入量和硫酸铵饱和度基础上，采用1mol/LHCl或1mol/L NaOH改变体系pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，研究体系pH对黄参蛋白分离效果的影响，结果见图3。

图3 体系pH值对黄参蛋白质三相萃取效果的影响Fig.3 Effect of system pH on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

在目标蛋白质等电点与三相体系pH接近时，硫酸铵与目标蛋白质之间的相互作用最小，影响目标蛋白质分离效果。当体系pH大于目标蛋白质等电点时，蛋白质带有负电荷，主要有富集于三相体系下相趋势；当体系pH小于目标蛋白质等电点时，蛋白质带有正电荷，利于蛋白质在中间相形成固相沉淀物；由图3可知，当体系pH值为4.5时，蛋白质提取率达到最大值，为（87.1±0.119）%；与其他不同体系pH获得的蛋白提取率进行比较，差异显著（P＜0.05）；体系pH偏高或偏低，均会影响其提取效果。因此，确定体系pH值为4.5。

2.1.4 萃取温度对黄参蛋白分离效果的影响

温度是影响三相萃取目标产物因素之一，研究体系萃取温度对黄参蛋白分离效果的影响，结果见图4。由图4可知，当温度为25℃时，提取率达到最高，为（87.43±0.136）%；分别与萃取温度为20℃和30℃蛋白质提取率进行比较，差异显著（P＜0.05）；继续增加萃取温度时，蛋白质提取率基本不变，且差异不显著（P＞0.05）；原因可能是在较低温度条件下进行萃取时，会影响目标产物传质效果，导致三相形成较慢，且目标蛋白质与有机溶剂叔丁醇接触时间长，会影响蛋白质生物活性；温度较高时，在提高传质效果的同时，可能会促使部分蛋白质在固液界面发生溶解，导致中间相目标物质减少，影响其提取效果。因此，确定萃取温度为25℃。

图4 萃取温度对黄参蛋白质三相萃取效果的影响Fig.4 Effectof extraction temperature on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

2.1.5 萃取时间对黄参蛋白分离效果的影响

萃取时间是影响目标成分萃取效果另一因素；其不仅影响目标产物得率，在工业化生产中极大影响着生产成本，研究体系萃取时间对黄参蛋白分离效果的影响，结果见图5。由图5可知，萃取时间对黄参蛋白质提取率影响得率差异不显著（P＞0.05），当萃取时间为15m in后，黄参蛋白质提取率随萃取时间变化趋势不明显。因此，确定萃取时间为15min。

图5 萃取时间对黄参蛋白质三相萃取效果的影响Fig.5 Effect of extraction time on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

2.2 三相萃取条件优化正交试验

在单因素试验基础上，对硫酸铵饱和度、蛋白质提取液与叔丁醇体积比、体系pH值、萃取温度进行L9（34）正交试验设计，正交试验结果与分析见表1。

表1 三相萃取条件优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonalexperiments for three phase-partitioning extraction conditions optim ization

由表1可知，各个因素对蛋白质提取率影响大小顺序为体系pH值＞硫酸铵饱和度＞蛋白质提取液与叔丁醇体积比＞萃取温度；获得三相萃取黄参蛋白质最佳萃取条件为A2B2C2D1，即硫酸铵饱和度为50%，蛋白质提取液和叔丁醇体积比为1.0∶1.0，萃取体系pH值为4.5，萃取温度为20℃。在此优化条件下，进行3次重复试验，蛋白质平均提取率为（88.71±0.54）%。由表2可知，硫酸铵饱和度、蛋白质提取液和叔丁醇体积比、体系pH值对蛋白质提取影响达到极显著水平（P＜0.01）。

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonalexperiments results

2.3 三相萃取黄参蛋白与盐析沉淀效果的比较

将黄参蛋白质提取液分别采用三相萃取和盐析沉淀，蛋白质提取率分别为（88.71±0.54）%和（76.49±0.70）%。结果表明，三相萃取法要优于硫酸铵沉淀法，经萃取后中间相为固体，不需经过脱盐处理，操作简单易得。

2.4 黄参蛋白质体外抗氧化活性测定

将上述两种方法制备的黄参蛋白质组分SRP-1和SRP-2进行了体外抗氧化研究，分析其DPPH、ABTS+自由基清除率、FRAP值和ORAC指数的影响，结果见图6。

图6 黄参蛋白质清除DPPH自由基（a）、ABTS+自由基（b）、铁还原力（c）及氧自由基吸收能力指数（d）检测结果Fig.6 Determ ination results of DPPH radical(a),ABTS+radical(b)scavenging activities,ferric reducing activity powers(c)and oxygen radicalabsorbance capacity index(d)of Sphallerocarpus gracilis protein

由图6a可知，在样品质量浓度为0.2～1.0mg/m L范围内，蛋白组分SGP-1、SGP-2和VC对DPPH自由基清除效果呈现浓度依赖性，且蛋白组分SGP-1对DPPH自由基清除能力高于SGP-2；当样品质量浓度为0.4mg/m L时，蛋白组分SGP-1和SGP-2对DPPH自由基效果分别为（61.25±1.51）%和（51.2±1.40）%；蛋白组分SGP-2对DPPH自由基清除效果均低于阳性对照VC；相反，当质量浓度≥0.6mg/m L之后，蛋白组分SGP-1对DPPH自由基清除效果强于阳性对照VC；可能是由于制备的两个蛋白质样品中化学组成差异造成的。

由图6b可知，蛋白组分SGP-1、SGP-2和VC对ABTS+自由基清除效果随着质量浓度在0.2～1.0mg/m L范围内逐渐增加呈现浓度依赖性，且蛋白组分SGP-1、SGP-2对ABTS+自由基清除效果均小于VC；当质量浓度为1mg/m L时，蛋白组分SGP-1和SGP-2具有相似的ABTS+自由基清除效果，清除率分别为（89.2±1.46）%和（89.1±1.39）%；蛋白组分SGP-1质量浓度为0.2mg/m L时，对ABTS+自由基清除率为（55.36±1.32）%；蛋白组分SGP-2质量浓度为0.4mg/m L时，对ABTS+自由基清除率为（59.2±1.26）%；可能是蛋白质样品中其他成分在一定程度上影响其抗氧化强弱；因此，样品对ABTS+自由基清除效果不同归因于样品中蛋白质及其成分含量差异。

由图6c可知，不同样品抗氧化能力强弱呈现浓度依赖性，且均小于阳性对照VC；这种趋势与图6b具有显著相似性；蛋白组分SGP-1具有最大的还原力；当样品质量浓度为1mg/m L时，蛋白组分SGP-1和SGP-2的FRAP值分别为0.99mmol/L和0.59mmol/L；结果表明，蛋白组分SGP-1具有更强给Fe3+提供电子的能力；蛋白组分SGP-1比SGP-2具有结合Fe3+稳定性更高，其具有更高FRAP值；说明其样品组成中蛋白质含量多少显著影响其抗氧化能力。

由图6d可知，蛋白组分SGP-1和SGP-2两个样品ORAC指数分别为（109±1.56）μmolTE/mg和（65±1.42）μmolTE/mg；与蛋白组分SGP-2相比，蛋白组分SGP-1具有显著的ORAC指数（P＜0.05），其抑制自由基的抗氧化能力就越强。说明两个样品均可作为抗氧化剂清除2,2'-盐酸脒基丙烷（2,2'-azobis（2-amidinopropane）dinydrochloride，AAPH）形 成的自由基；曹亚兰等[20]报道大豆抗氧化肽与ORAC指数有直接相关性；结合以上数据可推断，SGP-1和SGP-2的ORAC指数差异主要受两个样品中化学成分影响；因此，ORAC指数已成为衡量中药材或功能食品总抗氧化能力非常重要指标之一。

3结论

本研究采用三相萃取黄参蛋白质，对其萃取条件优化基础上，并与传统盐析沉淀方法进行了比较，表明三相萃取制备的黄参蛋白质具有较高蛋白质提取率；对两种方法制备的蛋白质分别命名为SGP-1和SGP-2，并对两个样品体外抗氧化活性进行比较研究。结果表明，当硫酸铵饱和度为50%，蛋白质提取液和叔丁醇体积比为1.0∶1.0，萃取体系pH值为4.5，萃取温度为20℃。在此优化条件下，进行3次重复试验，蛋白质平均提取率为（88.71±0.54）%。蛋白组分SGP-1和SGP-2对DPPH、ABTS自由基最大清除率分别为（61.25±1.51）%、（51.2±1.40）%和（89.2±1.46）%、（89.1±1.39）%；蛋白组分SGP-1和SGP-2的FRAP值、ORAC指数分别为0.99mmol/L、（109±1.56）μmol TE/mg和0.59mmol/L、（65±1.42）μmol TE/mg。两个样品在一定质量浓度范围内抗氧化活性均呈现浓度依赖性；与SGP-2相比，SGP-1具有较高抗氧化活性，可能与样品中蛋白质含量及其他成分或结构有关，然后，抗氧化性与样品之间复杂关系受多种因素的影响，后续工作进一步阐明蛋白质抗氧化活性机制，为黄参蛋白质深入研究提供科学依据。