阿那白滞素对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及对TLR4/TRAF6通路的影响

病毒性心肌炎属于心血管系统疾病，临床表现无明显特异性，大部分病人病情较轻，有一部分逐渐发展为慢性心肌炎，或因长期得不到治疗病毒发生病理免疫反应，发展为扩张型心肌病[1]。目前研究认为由病毒侵入所导致的心肌组织炎症反应是病毒性心肌炎病情加重的重要原因[2-3]。阿那白滞素属于重组人白介素-1受体拮抗剂，在类风湿性关节炎治疗中应用广泛。国外最新研究显示阿那白滞素可用于心肌炎治疗，且抑制炎症反应效果较好，国内关于阿那白滞素治疗心肌炎方面的报道较少[4]。本研究通过制备病毒性心肌炎小鼠模型，给予阿那白滞素干预，旨在探究阿那白滞素对心肌的保护作用以及对Toll样受体4(TLR4)与肿瘤坏死因子受体活化因子6(TRAF6)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验病毒 4周龄无特定病原体(SPF)清洁级雄性BALB/c小鼠40只，体重(18.64±2.18)g，由广东省农业科学院动物卫生研究所提供，合格证书为：SYXK(粤)2016-0315，所有小鼠均在25 ℃、湿度为80%的环境中统一喂养，严格按照SPF级动物饲养要求进行饲养。柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)由南方医科大学病原微生物实验室惠赠，该病毒已在Hela细胞上传代，经过反复冻融3次后测定半数组织感染剂量为10-3/L。

1.2 实验试剂与仪器 阿那白滞素(湖北荆州市天济药业有限公司；生产批号：20160930；规格：每片0.3 g)；心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自上海生物工程有限公司；兔抗鼠TLR4、TRAF6、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)、TIR结构域接头分子(TIR domain junction molecule，TRIF)单克隆抗体购于美国Gibco公司；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二体购于美国R&D公司；伊红、苏木素购于美国Sigma公司；ABC试剂盒购于美国Vector公司；2×SYBR Premix Ex Taq II购于宝生物工程(大连)有限公司；RNA提取和反转录试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、α-MEM培养基购于美国Gibco公司；胰蛋白酶购于美国Amresco公司；CO2培养箱购于Forma Scientific公司，低温离心机、蛋白凝胶成像仪购于Bio-Red公司。Nikon80I显微镜购于日本Nikon公司。cx9全自动生化检测仪购于美国贝克曼公司。

1.3 小鼠病毒性心肌炎模型制备及分组 将小鼠按照随机数字表法平均分为4组，正常组(A组)、模型组(B组)、阿那白滞素低剂量组(C组)与阿那白滞素高剂量组(D组)，每组10只。正常组小鼠注射不含CVB3的病毒稀释液，模型组经腹腔注射0.1 mL CVB3病毒悬浮液，每日1次，连续注射3 d；阿那白滞素低剂量组在模型组基础上经腹腔注射0.02 mL/g阿那白滞素，每日给药1次，给药2周；阿那白滞素高剂量组在模型组基础上经腹腔注射0.2 mL/g阿那白滞素，每日给药1次，给药2周。

1.4 标本处理与收集 在小鼠最后1次给药处理24 h后进行断头取血，在血液中加入抗凝剂，迅速分离心脏，将其中一部分置于-80 ℃冰箱中保存，另一部分加入10%多聚甲醛中固定后常规制备石蜡切片。

1.5 血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)水平测定 采用cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6酶联免疫检测试剂盒以及全自动生化检测仪进行操作，严格按照试剂盒操作以及仪器说明书执行。

1.6 心肌组织苏木素-伊红染色(HE染色)以及马松染色(Masson染色) HE染色：将制备好的心脏组织石蜡切片在二甲苯溶液中固定30 min，在质量分数为100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分别进行脱水5 min；流水冲洗后，加入苏木素进行染色10 min，浸入1%盐酸后用蒸馏水进行冲洗。加入伊红染液均进行染色3 min，依次在75%、85%、95%、100%中脱水2 min，加入二甲苯进行透明处理，滴加中性树脂进行封片，将切片放置显微镜下进行观察，每张切片选取5个视野，统计视野中坏死区域、炎症浸润区域占整个视野的比例，无病变区域为0分，病变区域<25%为1分，病变区域25%～<50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。Masson染色：将组织制备成石蜡切片，加入二甲苯进行脱蜡，在乙醇中进行脱水后，流水清洗后进行铬化处理，加入苏木精染色5 min，水洗后在盐酸乙醇中分化，水洗后加入伊红染液染色5 min，加入2%冰醋酸进行清洗，置于1%磷钼酸中5 min，加入苯胺蓝染色5 min，加入2%冰醋酸进行清洗后，用无水乙醇进行脱水处理后封片。利用Metic Med 6.0软件计算心肌胶原纤维所占比例(CVF)，计算方式为：CVF=胶原面积/总面积。

1.7 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 将心脏组织剪碎加入胰酶溶液进行消化，用尼龙网过滤收集心肌细胞，在75%冰乙醇中过夜固定，离心后收集细胞，在磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中清洗，调整细胞密度为106/mL，添加核糖核酸酶(RNAase)室温下孵育30 min，加入碘化丙啶(PI)溶液后室温下孵育10 min，在细胞流式仪中分析细胞DNA含量，利用Cellfit软件选取104个细胞分析，观察并记录AP区域细胞比例，即细胞凋亡率。

1.8 逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)测定心肌组织中TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA表达 从冰箱中取出冰冻心脏组织，在PBS缓冲液中清洗后，用无菌剪刀剪碎，采用RNA提取试剂盒(Takara公司)对总RNA进行提取后反转录为cDNA，RT-PCR引物由广州Invitrogen公司合成，序列详见表1。反应体系：10×cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8 μL， 2×SYBR Mix 10 μL。按照反应程序95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min。利用CFX manager 3.0软件进行Cq值分析，以GADPH作为内参基因按照2-ΔΔCq算法进行基因相对定量表达分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.9 蛋白质印迹(Western blot)法检测心脏组织TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF蛋白表达 将心脏组织剪碎后加入蛋白裂解液在冰上反应30 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备8%分离胶、12.5%浓缩胶，蛋白上样量统一为30 μg，当样品进入浓缩胶后电压设置为80 V，进入分离胶后，电压调整为120 V，电泳结束后转移蛋白凝胶至PVDF膜上，转膜反应在冰上进行，电压设置为100 V，进行1 h转膜反应，加入TBST溶液进行清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀释液(TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF抗体)，4 ℃振荡过夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀释液，室温下孵育2 h，PBST溶液清洗后在凝胶成像仪中观察蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 各组血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6水平比较 与A组比较，B组血清cTnT、CK-MB、MDA、TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，SOD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组、D组cTnT、CK-MB、MDA、TNF-α、IL-1、IL-6水平降低，SOD水平升高，且D组较C组变化明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6水平比较(±s)

与A组比较，1)P<0.05；与B组比较，2)P<0.05；与C组比较，3)P<0.05

2.2 心肌组织HE染色以及Masson染色结果 HE染色及Masson染色显示：A组心肌组织排列较整齐，无炎性细胞浸润；B组心肌组织出现较明显炎性细胞浸润，局部心肌细胞坏死，且出现较多空泡；C组心肌组织炎性细胞浸润明显较少，部分可见心肌细胞坏死；D组心肌组织炎性细胞浸润基本消失，仅少部分可见炎性细胞浸润，并未出现心肌细胞坏死。详见图1、图2。与A组比较，B组心肌组织病理评分、心肌纤维比例升高；与B组比较，C组、D组心肌组织病理评分、心肌纤维比例降低；与C组相比，D组心肌组织病理评分、心肌纤维比例降低；差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3、图4。

图1 各组心肌细胞HE染色(×100)

图2 各组心肌细胞Masson染色(×100)

与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05

图3各组心肌病理组织评分比较

与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05

图4各组心肌纤维比例比较

2.3 心肌细胞凋亡情况 与A组比较，B组诱导处理后DNA含量降低，C组经阿那白滞素处理后DNA含量有所升高，D组细胞DNA含量升高幅度高于C组。C组、D组心肌细胞凋亡率低于B组，D组凋亡率低于C组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图5、图6。

图5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况

与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05

图6各组心肌细胞凋亡率比较

2.4 心肌组织TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表达情况 与A组比较，B组TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表达升高；与B组比较，C组TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表达降低；与C组比较，D组TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIFmRNA、蛋白表达降低；差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图7、图8。

与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05

与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05

3 讨 论

病毒性心肌炎主要是病毒进入心肌引发的心肌间质炎症反应，其中CVB3为主要致病病毒，其进入体内后迅速繁殖使病人发生病毒血症，进而侵犯心肌间质，刺激心肌炎症细胞释放大量炎症因子，进一步对病情进展进行调控。临床上在病人发病初期给予抗病毒药物进行治疗，但疗效并不稳定，因此寻找治疗病毒性心肌炎的新型药物十分重要[5]。阿那白滞素在临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎，最近有研究报道阿那白滞素被批准用于治疗心肌炎[6]，为探究其作用效果与作用机制，本研究设计了一系列实验以期为心肌炎的治疗提供新的参考。

目前许多学者均选择小鼠进行病毒性心肌炎模型制备，有关研究显示BALB/c小鼠对心肌病毒灵敏性较高，心肌细胞表面具有特异性CVB3受体，在进行接种CVB3病毒后发生心肌炎概率可达100%[7]。此外，还有研究显示通过给小鼠注射CVB3病毒后，在饲养第5天可以在小鼠心脏中检测到病毒，染色结果也显示小鼠心肌组织发生明显炎症浸润反应[8]。关于病毒选择方面，以往有学者采用巨噬细胞病毒建立病毒性心肌炎模型，但病毒滴度水平明显低于CVB3病毒滴度，且重复性与稳定性均较好[9-10]，因此，本研究选择BALB/c小鼠作为研究对象，通过腹腔注射CVB3病毒构建病毒性心肌炎模型。心肌组织正常新陈代谢时产生较多活性氧、SOD，当心肌组织受到病毒攻击后，病毒繁殖需要大量能量，产生大量氧自由基，进而消耗大量SOD进行清除自由基，使机体内SOD水平迅速降低[11]，此外细胞中氧化自由基数量升高后，还能与细胞膜中不饱和脂肪酸结合后生成MDA，因此测定MDA能够反映细胞损伤程度[12]。cTnT、CK-MB主要存在于心肌中，当心肌发生损伤后胞浆中游离的cTnT、CK-MB迅速释放，导致血清中cTnT、CK-MB水平升高。有关研究显示心肌受损后cTnT升高至原水平的10倍，CK-MB升高至原水平的5倍，两种指标对于心肌损伤十分敏感，在临床上常用于病毒性心肌炎的诊断[13]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组SOD含量降低，MDA、cTnT、CK-MB含量升高，经阿那白滞素处理后SOD含量升高，MDA、cTnT、CK-MB含量降低，表明心肌细胞损伤与细胞过氧化能力增强、氧自由基清除力下降相关，给予阿那白滞素后MDA、cTnT、CK-MB水平得到改善，提示阿那白滞素能降低细胞过氧化能力，提高氧自由基清除力，进而发挥对心肌细胞的保护作用。近期有研究显示TNF-α、IL-1、IL-6与心肌病变的发生发展相关[14]。国外学者研究显示TNF-α在病毒性心肌炎感染初期，可被病毒识别作为抗原激活巨噬细胞，高水平的TNF-α能够改变膜蛋白进而损伤心肌[15]。国内学者研究显示病毒性心肌炎初期病人体内IL-1、IL-6水平升高，使机体具有一定的防御作用，而大量表达后会加重病情的恶化[16]。本研究显示经阿那白滞素处理后小鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平逐渐降低，且药物浓度越高，TNF-α、IL-1、IL-6水平降低越明显，表明阿那白滞素能够抑制病毒性心肌炎所导致的炎症反应，并具有药物依赖性。炎性细胞的浸润以及心肌细胞坏死是病毒性心肌炎的主要病理特点[17]，本研究通过HE染色与Masson染色显示：模型组小鼠心肌细胞出现明显炎性细胞浸润，心肌细胞坏死、空泡；经阿那白滞素干预后细胞浸润、心肌细胞坏死明显降低，这与国内外相关研究结果相符[18-19]。近年来关于心肌细胞凋亡在心脏疾病中报道较多，相关研究证实病毒感染后寄生在宿主细胞内，激活凋亡信号通路启动凋亡体系，引发心肌细胞凋亡出现心肌细胞的丢失或减少[20-21]。本研究结果显示模型组小鼠心肌细胞DNA含量明显下降，出现心肌细胞凋亡，经阿那白滞素干预后细胞数量有所增加，这与国内外相关研究相符[22]。

TLRs属于介导天然免疫的跨膜模式识别受体，对多种病原体均能够识别，在免疫应答反应中发挥重要的作用，不仅存在于内皮细胞、淋巴结、胸腺中，同时也存在于心肌细胞中[23]。TLR4是TLR家族成员之一，在机体炎症反应、免疫细胞成熟、分化中发挥重要作用[24]，相关研究显示其能够诱导巨噬细胞、肝脏细胞或脂肪细胞表达相关炎症因子[25]。在TLR4信号通路中，TLR4通过病毒跨膜模式识别受体后与TIR结构域结合，如MyD88、TRIF，引起自身磷酸化后与TRAF6结合，使其发生泛素化，激活TAK复合体，进一步激活NF-κB，激活一系列炎症因子的表达。相关研究显示TLR4通过激活效应因子MyD88，进而激活NK-κB信号通路，促进白介素-12(IL-12)、IL-6、TNF-α等炎症因子转录[26]。本研究显示模型组大鼠TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF DNA、蛋白表达量升高，经过阿那白滞素干预后TLR4/TRAF6相关蛋白表达量均下降，表明TLR4/TRAF6信号通路参与病毒性心肌炎的发展，阿那白滞素对病毒性心肌炎的治疗可能是通过下调TLR4/TRAF6相关蛋白的表达来实现的。

本研究也存在一定的局限性，选取的阿那白滞素浓度梯度较少，后期需要设置不同梯度的阿那白滞素浓度进行进一步验证，此外并未对阿那白滞素给药时间进行研究，以便探究最佳治疗效果。

综上所述，阿那白滞素对病毒性心肌炎小鼠心肌组织具有保护作用，可能与抑制TLR4/TRAF6信号通路相关。