西方膳食对载脂蛋白E敲除小鼠的影响*

杨 林 黎桂玲 刘 科 代路路 李金凤 朱叶萌 邝少松

(1.广东省医学实验动物中心，佛山 528248)(2.华南农业大学，广州 510642)

动物体内的脂类物质代谢异常时，多余的脂质会沉积在血管壁上，并逐渐形成斑块，使血管内皮增厚、变硬，是引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的重要原因之一。载脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)主要存在于乳糜微粒(chylomicron, CM)、极低密度脂蛋白(very low desity lipoprotein, LDL)等多种血浆脂蛋白中，可介导脂蛋白残粒的摄取，维持血浆胆固醇的平衡、促进泡沫细胞中胆固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，该基因缺陷将使体内脂代谢发生紊乱。ApoE基因敲除的纯合小鼠(ApoE-/-)可正常存活和繁殖，当给予适当的高脂饮食时，可导致各种高脂蛋白血症[1-3]，并且其斑块分布与人类的动脉粥样硬化斑块的分布相似，在动脉粥样硬化的研究中发挥重要作用。本文使用西方膳食饲料和标准饲料两种不同脂肪和胆固醇含量的饲料喂养ApoE-/-基因敲除小鼠，探究其血生化指标和动脉病理学的改变，为后续该模型小鼠的使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取约3月龄的SPF级载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)36只和C57BL/6J小鼠18只，其来源于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2013-002]，动物饲养环境条件为20～26 ℃，相对湿度40%～70%。36只ApoE-/-小鼠分为6组，每组6只，分别为：喂养西方膳食(主要成分见表1)3个月(H6)、4个月(H7)和5个月(H8)组，和标准饲料(主要成分见表2)3个月(M6)、4个月(M7)和5个月(M8)组。西方膳食饲料含21%脂肪、0.25%胆固醇；标准饲料含10%脂肪。18只C57BL/6J小鼠即对照组小鼠(所喂饲料见表2)，共分3组，每组6只，分别为：6月龄(WT6)、7月龄(WT7)和8月龄(WT8)组，饲养期间自由饮水。

表1 西方膳食饲料主要组分及营养含量Table 1 Main components and nutrient contents of Western diet

表2 标准饲料及C57小鼠饲料主要组分及营养含量Table 2 Main components and nutrient contents of standard diet and C57 mice diet

1.2 主要试剂和仪器

试剂：溶血剂，DH-910，DH-680；清洗剂，DH-520，DH-620；稀释液，DH-640(东湖仪器试剂有限公司)

仪器：轮转切片机(德国LEICA公司 RM2135)，生物组织全自动脱水机(湖北孝感医用仪器有限公司 TS-12C)，生物组织包埋机及冷冻机(湖北孝感医用仪器有限公司 BM-VII)，摊片烤片机(湖北孝感医用仪器有限公司 CS-VI)，生物组织全自动染色机(湖北孝感医用仪器有限公司 RS-18)，正置光显微镜(Olympus BX41)，病理图像分析系统(Image-Pro Expess 5.1.1.14)，血液分析仪(NIHONKOHDEN)等。

1.3 血脂测定

9组小鼠喂养到指定月龄后，称体质量并摘取眼球取血(不空腹)，离心，分离血清，使用NIHONKOHDEN血液分析仪测定各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.4 样本取材及制备

动物处死后，取主动脉根部，4%中性甲醛固定，常规脱水、透明、浸腊、包埋、切片(4 μm)、烤片，常规HE染色，封片。在光学显微镜下观察主动脉弓有无动脉粥样硬化病变，并用OLYMPUS BX41显微镜拍照。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 血脂水平的变化

与同月龄的对照组小鼠相比，高脂日粮喂养的H组与普通日粮喂养的M组的APOE基因敲除小鼠在TC和LDL-C两方面显著升高，并且H组显著高于M组小鼠。在HDL-C方面，H6组与M6组小鼠显著高于WT6组小鼠，并且H6组小鼠也显著高于M6组小鼠；同样H8组与M8组小鼠在HDL-C方面也显著高于同WT8组小鼠，H8组小鼠也显著高于M8组；在7月龄组，H7与M7组小鼠显著高于WT7组小鼠，但是H7组与M7组小鼠相比并没有显著性差异。各组血浆TG没显著性差异，无统计学意义。

表3 6月龄各组小鼠血清血脂水平比较Table 3 Comparison of lipid levels in sera among the 6 months old mice

注：不同字母代表具有统计学差异(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表4 7月龄各组小鼠血清血脂水平比较Table 4 Comparison of lipid levels in sera among the 7 months old mice

注：不同字母代表具有统计学差异(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表5 8月龄各组小鼠血清血脂水平比较Table 5 Comparison of lipid levels in sera among the 8 months old mice

注：不同字母代表具有统计学差异(P<0.05)

Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

2.2 ApoE-/-小鼠主动脉弓AS病变的观察

在高倍镜下观察，WT6组：6只动物主动脉弓镜下均未见动脉粥样硬化(见图1 A)。M6组：4只动物(4/6)主动脉弓镜下见动脉粥样硬化，泡沫细胞聚集(见图1B)。H6组：5只动物(5/6)主动脉弓镜下均见动脉粥样硬化(见图1C)。

图1 6月龄小鼠的HE染色情况注：A.WT6组主动脉弓未见病变；B.M6组主动脉弓部分出现动脉粥样硬化；C.H6组大多数出现动脉粥样硬化Fig.1 HE staining of 6 months old miceNote:A. no lesions of aortic arch in WT6 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M6 group; C. atherosclerosis occurred mostly in H6 group

WT7组：1只动物(1/6)可见动脉粥样硬化，内膜下纤维斑块形成，斑块内可见泡沫细胞及胆固醇结晶。其余动物主动脉弓未见明显异常(见图2A)。M7组：3只动物(3/6)可见动脉粥样硬化，主要表现为血管内膜下纤维斑块形成，斑块内可见泡沫细胞及胆固醇结晶，其中1只动物(1/6)斑块局部可见坏死钙化灶。其余动物主动脉弓未见明显异常(见图2B)。H7组：6只动物(6/6)均可见动脉粥样硬化，主要表现为血管内膜下纤维斑块形成，斑块内可见泡沫细胞，其中5只动物(5/6)斑块内可见胆固醇结晶(见图2C)。

图2 7月龄小鼠的HE染色情况注：A.WT7组主动脉弓未见病变；B.M7组主动脉弓部分出现动脉粥样硬化；C.H7组全部出现动脉粥样硬化Fig.2 HE staining of 7 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT7 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M7group; C. atherosclerosis occurred mostly in H7 group

WT8组：所有动物均未见动脉粥样硬化(见图3A)；M8组：4只小鼠(4/6)主动脉弓镜下可见动脉粥样硬化(见图3B)；H8组：5只小鼠(5/6)主动脉弓镜下可见动脉粥样硬化(见图3C)。

图3 8月龄小鼠的HE染色情况注：A.WT8组主动脉弓未见病变；B.M8组主动脉弓部分出现动脉粥样硬化；C.H8组大多数出现动脉粥样硬化Fig.3 HE staining of 8 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT8 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M8group; C. atherosclerosis occurred mostly in H8 group

3 讨论

以往的AS动物模型多采用极高含量的胆固醇、脂肪的饲料长期饲养制作，但由于小鼠、大鼠等动物先天具有胆固醇抵抗的特性，在制作模型时，胆固醇负荷往往是正常膳食的数十倍的急性过程，因此与人类的病症情况相差甚远[4-6]。ApoE基因敲除小鼠是由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室于1992年应用胚胎干细胞基因敲除技术培育成功。有研究表明该小鼠用普通饲料喂养也可自发形成纤维斑块和复合斑块，高脂饲料喂养可以加速AS，并且动脉粥样硬化斑块分布与人类的相似[7]。田枫等[8]研究发现普通饲养的ApoE敲除小鼠12个月时，其主要血管仍呈现明显的动脉粥样特征，表明ApoE敲除小鼠是动脉粥样硬化研究的可靠的动物模型。据报道ApoE敲除小鼠，15～20周龄后逐渐出现纤维斑块，病变部位以主动脉根最为明显，其次为胸主动脉。

本研究中我们采用的是21%脂肪、0.25%胆固醇的“西方膳食”饲料和标准饲料(中等脂肪含量)对ApoE-/-小鼠进行诱导，经过3个月、4个月和5个月的诱导后发现，相同月龄下，在TC和LDL-C方面，西方膳食组和标准饲料组显著高于对照组(WT组)，同时西方膳食组也显著高于标准饲料组；在HDL-C方面，饲喂3个月与5个月表现出同样的结果。但是在饲喂4个月时，西方膳食组和标准饲料组都显著高于对照组(WT组)，两组无显著差异。在主动脉弓病理切片及染色方面，相同月龄下，西方膳食组主动脉斑块明显并且AS发病率明显升高。该小鼠可为AS的多方面研究提供有效的实验动物模型：药物筛选、分子干预等；以及AS病理学机制的相关研究等。

本研究用含有21%脂肪和0.25%胆固醇的西方膳食饲料(高脂饲料)和10%脂肪的标准饲料饲养ApoE-/-小鼠，经3个月、4个月及5个月的饮食处理后，西方膳食饲料喂养的小鼠血浆总胆固醇、高密度脂蛋白指标(H6和H8)、低密度脂蛋白指标比标准饲料及对照组组(WT组)明显升高，同时标准饲料组也明显高于对照组(WT组)；在主动脉弓病理切片及染色方面，西方膳食饲料组和标准饲料组都表现出血管内膜纤维斑块形成，斑块内可见泡沫细胞及胆固醇结晶的典型动脉粥样硬化病理特征。表明：西方膳食饲料及标准饲料均可诱导ApoE-/-小鼠表现AS病症，而且西方膳食饲料的诱导效果更明显。本研究观察动物经西方膳食饲料和标准饲料喂养后的血脂情况及ApoE-/-主动脉弓的病变特点，为该模型在心血管疾病等老年病学研究的广泛应用提供了基础资料。