微卫星与生化位点法对BALB/c小鼠遗传检测比较分析*

覃辉艳 陈华凤 王 芳 杨 慧 李 彬 张洁宏

(广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁 530028)

实验动物在生命科学研究中占有重要地位，实验动物的质量，特别是遗传质量，直接影响实验结果的准确性、科学性和重复性。近交系小鼠因其在实验中所表现出的一致性、再现性和敏感性，在科学研究中尤其是遗传学、肿瘤学研究有着不可替代的重要地位[1]。一直以来，对近交系小鼠的遗传质量监测常以生化标记法、免疫标记法等为主，大多为以检测表型变异推测基因变异，存在一定局限性。随着生物技术的发展，对近交系小鼠直接进行基因检测，则能更直接更有效地反应其遗传质量。微卫星 DNA(microsatellite DNA)，又称短串联重复序列(short tandem repeat，STR)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成。具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、呈共显性遗传、结果稳定可靠等特点，被认为是各类遗传标记检测中最有价值的一种。目前，国内已有学者利用微卫星标记检测技术开展近交系小鼠遗传质量分析研究，但与传统国家标准检测方法进行比较分析尚少见报道。因此，本研究应用20个微卫星位点对近交系BALB/c小鼠进行检测，同时采用现行国家标准生化标记法进行检测比较分析，验证微卫星遗传检测方法的可靠性，为该技术的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠共10只，为BALB/cAn亚系，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心繁殖，生产许可证号：SCXK(桂)2014-0002。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：Sigma高速冷冻离心机；Bio-Rad电泳仪；GelDoc-It2凝胶成像分析仪；ABI梯度PCR仪；ABI 3730XL测序仪等。

试剂：Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit核酸提取试剂盒；Takara Premix Ex TaqTMHot Start Version PCR反应试剂盒；实验小鼠遗传检测试剂盒等。

1.3 方法

1.3.1微卫星DNA检测

1.3.1.1 核酸样品制备：用灭菌剪刀剪取小鼠长约0.6 cm的尾尖组织，剪碎，置于1.5 mL的无菌离心管中。使用Qiagen公司货号为69504的试剂盒DNeasy Blood & Tissue Kit(50)提取核酸。核酸提取后采用ND-1000 紫外分光光度计分析提取核酸的纯度和浓度。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品是否含有主带。

1.3.1.2 微卫星位点选取与引物合成：根据文献[1-2]和最新MMDBJ数据库提供的信息，选择等位基因数多、多态性含量丰富的20个微卫星位点，覆盖小鼠的20条染色体，各位点引物使用FAM标记，由华大基因合成。引物编号和序列见表1。

表1 20 个近交系小鼠微卫星位点的 扩增条件和染色体分布Table 1 Amplification conditions and chromosome distribution of 20 inbred mice microsatellite loci

1.3.1.3 PCR反应：PCR反应体系为：Premix Ex Taq Hot Start Version 10 μL、模板1 μL、10 μmol/L正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、无酶水补足至20 μL。扩增程序为：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s，最佳退火温度(见表1)30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃保持10 min。

1.3.1.4 毛细管电泳：将甲酰胺与分子量内标按100∶1的体积比混匀后，取9 μL加入上样板中，再加入1 μL稀释10倍的PCR产物，使用ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳。

1.3.2近交系小鼠生化标记检测:参照GB/T 14927.1—2008 《近交系小鼠、大鼠生化标记检测法》进行。

1.4 数据处理

1.4.1微卫星DNA检测:利用Genemarker 中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小数据。

1.4.2生化标记检测: 与标准条带进行对照判读。

2 结果

2.1 微卫星DNA标记检测

各样品各检测位点毛细管电泳检测的片段大小见表2。各样品各检测位点DNA片段大小相同，没有新的等位基因出现，符合近交系要求。

表2 各样品各微卫星位点检测结果

Table2Themicrosatellitemarkerresultsofeachsample

检测位点片段大小/bp1号2号3号4号5号6号7号8号9号10号D1Mit3183183183183183183183183183183D2Mit15139139139139139139139139139139D3Mit29202202202202202202202202202202D4Mit1388888888888888888888D5Mit13174174174174174174174174174174D6Mit1245245245245245245245245245245D7Mit228136136136136136136136136136136D8Mit33222222222222222222222222222222D9Mit90130130130130130130130130130130D10Mit12238238238238238238238238238238D11Mit4246246246246246246246246246246D12Mit2133133133133133133133133133133D13Mit3187187187187187187187187187187D14Mit5179179179179179179179179179179D15Mit179154154154154154154154154154154D16Mit79132132132132132132132132132132D17Mit11148148148148148148148148148148D18Mit64169169169169169169169169169169D19Mit16132132132132132132132132132132DXMit1693939393939393939393

2.2 生化标记检测

Akp1等14个生化标记基因均为纯合，个体间生化标记表型均一致，且根据国家标准，符合品系特征, 见表3。

表3 各样品各生化标记位点检测结果Table 3 The biochemical marker results of each sample

注：a表示：在Ce2、Mod1、Pgm1位点为快带，在Es3、Es10、Gpi1、Idh1、Pep3位点为慢带；b表示：在Car2、Gpd1位点为快带，在Akp1、Es1、Trf位点为慢带；d表示：在Hbb位点为慢带。

Note：a represent fast band at loci Ce2, Mod1 and Pgm1, and slow band at loci Es3, Es10, Gpi1, Idh1 and Pep3.b represent fast band at loci Car2 and Gpd1, and slow band at loci Akp1, Es1 and Trf.d represent fast band at locus Hbb.

3 讨论

近交系是经至少连续20代的全同胞兄妹或亲代与子代交配培育而形成的具有稳定性状特征和繁殖能力的实验动物品系。按照国家标准要求，近交系动物近交系数应大于99%。BALB/c小鼠是目前生命科学研究中最广泛应用的近交系之一，各国均有生产和应用。我国于1985年从美国NIH引进到中国医学科学院实验动物研究所，为BALB/c第180代，历经多年培育，至今已在国内形成几十个群体。因群体数量较多，对相应群体进行遗传检测分析，不仅可了解其遗传质量，建立其遗传背景资料，且可阐明使用不同BALB/c小鼠群体进行实验的重复性和可比性。

微卫星DNA标记是继RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)技术之后发展起来的新一代分子遗传标记技术，自20世纪80年代以来，经过30年的不断发展，微卫星标记技术已被广泛应用于亲缘关系鉴定、人类疾病诊断、实验动物遗传质量分析、生物群体遗传结构与物种资源保护等多领域[3]。目前，微卫星DNA的PCR产物分型检测方法主要有琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺电泳法、荧光标记引物毛细管电泳法、基于扩增子测序的分型法等[4]。王洪等[1]、刘先菊等[5]与王越甲等[6]分别采用琼脂糖凝胶电泳法优选近交系小鼠微卫星基因位点分析了国内常用近交系小鼠的遗传概貌。陈振文等[7]、欧阳兆和等[8]与韩喜彬等[9]分别运用微卫星标记和聚丙烯酰胺电泳法对国内近交系小鼠进行了遗传质量分析。近年来，倪丽菊等[2]和李银银等[10]分别利用微卫星标记和毛细管电泳法分析了国内多个品系近交系小鼠的遗传状况。毛细管电泳又称高效毛细管电泳，是一种高效液相分离法，是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物，离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效快速分离。与传统电泳法操作繁琐，分离率低、定量困难相比，毛细管电泳具有易自动化、分析速度快、分离效率高、定量准确、操作方便等优点。本研究采用20个多态性含量丰富的微卫星位点，采用荧光标记引物毛细管电泳法对BALB/c小鼠进行遗传质量分析，研究结果显示，各样品20个微卫星位点DNA片段大小相同，没有新的等位基因出现，生化标记检测结果亦显示Akp1等14个生化标记基因均为纯合，个体间生化标记表型均一致，且符合国家标准确定的品系特征。微卫星DNA检测结果与传统的生化标记检测结果一致，比对结果显示，微卫星DNA检测可应用于实验动物遗传质量评价，且微卫星DNA检测比生化标记检测覆盖面更广，荧光标记引物毛细管电泳法检测结果更准确，更能直接有效地反应实验动物的遗传质量。近年来的研究也表明微卫星DNA标记可区分近交系小鼠不同品系和亚系，可有效运用于近交系小鼠遗传检测[1-2,5-10]。但目前，微卫星DNA标记技术仍存在一些问题，如无效等位基因的出现，在纯合体个体上，无效等位基因表现为无可见的扩增条带，通常会被认为是因PCR技术或DNA模板质量问题而被忽视[11]；此外，由于使用引物的不同，有时会导致所得试验结果差异较大。因此，在行业内，选定相应引物，并形成相关标准非常必要。