家蚕生物反应器表达A组轮状病毒结构蛋白VP7

王蓓蕾，孙爱群，李司

(浙江理工大学生命科学与医药学院 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，浙江 杭州 310018)

我国家蚕养殖历史悠久，随着经济发展我国家蚕养殖业逐渐现代化、科学化，每年可产蚕蛹30万t，占世界年产量80%[1]。而浙江省有4 700余年的栽桑养蚕历史，是全国蚕茧的主产省。自2000年蚕业管理改革以来，浙江省蚕茧产量最高可达9万多t[2]，有着丰富的蚕业资源。家蚕不仅具有农业经济价值，还具有食用和药用价值[3]。由于家蚕安全性高，生产成本低，能表达具有天然活性的哺乳动物蛋白，使得家蚕生物反应器被广泛地应用于科学研究和产业化生产，成为目前最有潜力的生产生物制品的昆虫表达系统[4]。

轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科(Reovirdae)轮状病毒属，是引起婴幼儿和一些动物急性肠胃炎的主要病原体[5]。在我国，猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)分布范围最广，致死率高，传染快，是公认的仔猪死亡“第一杀手”，每年对猪养殖业造成过百亿的经济损失[6]。此外，A组轮状病毒也会感染鸡、牛等常见的家禽家畜以及婴幼儿，不仅给农业、畜牧业造成严重经济损失，还导致全球范围内约600万婴儿因RV感染而死亡[7]。由于RV主要感染胃肠道，因此，使得RV疫苗的研发一直朝着价廉、口服的方向努力，目前上市的RV疫苗均是口服毒活疫苗，我国自主研发唯一的RV疫苗是兰州生物制品研究所有限责任公司生产的“罗特威”[8]。因此，RV疫苗的研发有着广阔的前景，需要我们研究开发更加安全、简单易行和经济实惠的轮状病毒口服疫苗。

轮状病毒属于RNA病毒，含有11个节段的双链RNA[9]。其中VP7蛋白是RV最外层的糖蛋白，含有能被细胞毒性T淋巴细胞识别的抗原决定簇，免疫原性强，可用作中和抗原[10]，因而是研究生产轮状病毒基因工程疫苗的首选蛋白[10-11]。已有学者利用基因工程技术表达VP7蛋白，如文程等[12]将人源A组轮状病毒VP7蛋白的全长基因通过PCR扩增后转到表达载体pLA上，并将pLA-VP7重组质粒转化到干酪乳杆菌中，成功地在干酪乳杆菌中表达了VP7蛋白，并通过Western blotting分析其具有良好的反应原性；张露等[13]成功地在大肠埃希菌中表达猪轮状病毒VP7蛋白。但这些原核表达系统无转录后加工，使得表达的VP7蛋白缺乏糖基化。因此，昆虫表达系统越来越受关注，Khodabandehloo等[14]将猴源轮状病毒VP7克隆到苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)导入苜蓿银纹夜蛾细胞，并成功地在注射VP7蛋白的兔子血清中检测到了相应的抗体。相比于原核表达系统，昆虫表达系统表达外源蛋白产生的抗体效价更高。

本研究构建A组轮状病毒的VP7重组家蚕杆状病毒，分别在感染BmN细胞、家蚕5龄幼虫以及蚕蛹中表达VP7蛋白，家蚕生物反应器具有以下优势：首先，与原核表达系统相比，增加了糖基化、磷酸化、酰基化等翻译后修饰加工过程[15]，其高级结构与天然相似，通过设计信号肽分子，能够增加膜蛋白或分泌型蛋白的表达[16]；其次，家蚕本身具有高营养价值、食疗保健功能、药用价值等优势。此外，家蚕生物反应器原料丰富廉价易得，生产成本低。因此，利用家蚕杆状病毒表达系统来表达A组轮状病毒的VP7基因，可以经济、高效、快速地获得大量安全的VP7蛋白，为研制新型的实用有效的A轮状病毒疫苗提供了一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

家蚕与蚕蛹购自浙江中奇生物药业股份有限公司。BmN细胞、野生型家蚕杆状病毒和家蚕细胞培养基由本实验室提供。家蚕细胞培养基成分TC-100、胎牛血清(FBS)购自GIBCO BRL公司。转染试剂购自Roche公司。一抗为VP7蛋白小鼠单克隆抗体购自重庆晶美公司。蛋白分子质量Marker、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体、转膜Buffer、ECL显色液以及细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司。医用胶片、牛血清白蛋白、PVDF膜、酶标板、终止液等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 重组转移载体pBacPAK8-VP7的构建

根据A组轮状病毒结构蛋白VP7(GenBank：AF260941.1)序列，从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orFig.cgi得知，ORF框49～1 029，共981个密码子，启动子为ATG，终止子为TAG。由金维智生物科技有限公司合成，并将VP7序列与质粒pBacPAK8构建成重组转移载体pBacPAK8-VP7。核苷酸序列如下：

1 ATGTATGGTA TTGAATATAC CACAATTCTA ATCTTTCTGA TATCAATCAT TCTACTCAAC

61 TATATATTAA AATCAGTGAC CCGAATAATG GACTACATTA TATATAGATT TTTGTTAATT

121 TCTGTAGCAT TATTTGCCTT AACTAAAGCT CAGAACTATG GACTTAATAT ACCAATAACA

181 GGATCAATGG ATACTGTATA CTCCAATTCT ACTCAAGAAG GAGTATTTCT AACATCCACA

241 TTATGTTTGT ATTATCCAAC TGAAGCAAGT AATCAAATCA GTGATGGTGA ATGGAAAGAC

301 TCATTATCGC AAATGTTTCT TACAAAAGGT TGGCCAACAG GATCAGTCTA TTTTAAAGAG

361 TACTCAAATA TTGTTGATTT TTCCGTTGAT CCACAATTAT ATTGTGATTA TAACTTAGTA

421 CTAATGAAGT ATGATCAAAA TCTTGAATTA GATATGTCAG AATTAGCTGA TTTGATATTG

481 AATGAATGGT TATGTAATCC AATGGATATA ACATTATATT ATTACCAACA ATCGGGAGAA

541 TCAAATAAGT GGATATCAAT GGGATCATCG TGTACTGTGA AAGTGTGTCC ACTGAATACA

601 CAAACGTTGG GAATAGGTTG TCAAACAACG AATGTAGACT CATTTGAAAC AGTTGCTGAG

661 AATGAAAAAT TAGCTATAGT GGATGTCGTT GATGGGATAA ATCATAAAAT AAATTTGACA

721 ACTACGACAT GTACTATTCG AAATTGTAAG AAGTTAGGTC CAAGAGAGAA TGTAGCTGTA

781 ATACAAGTTG GTGGCTCTAA TATATTAGAC ATAACAGCGG ATCCAACGAC TAATCCACAA

841 ATTGAGAGAA TGATGAGAGT GAATTGGAAA AGATGGTGGC AAGTATTTTA TACTATAGTA

901 GATTATATTA ATCAGATTGT ACAGGTTATG TCCAAAAGAT CAAGATCATT AAATTCTGCT

961 GCGTTTTATT ATAGAGTATA G

1.3 重组病毒BmNPV-VP7的构建

用陈建博士的复制缺陷型穿梭载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP7共转染BmN细胞，以获得重组病毒BmNPV-VP7。具体步骤如下：BmN细胞在24孔板中培养过夜。加0.3 μL RD-BmBacmid，1.5 μg pBacPAK8-VP7，1.5 μL转染剂，100 μL无血清培养基与500 μL离心管中，混匀静置15～30 min。将混合液加入细胞中，培养3～5 d。在细胞出现病变或者转染120 h之后，将24孔细胞培养皿每孔中的上清液按体积比1∶100接种到新的装有BmN细胞的培养皿中，培养2～5 d并观察细胞的病变情况。待细胞发病至破裂后，收集上清即重组病毒BmNPV-VP7，4 ℃保存。

1.4 VP7蛋白SDS-PAGE及Western blotting检测

1.4.1 家蚕细胞样品制备

用野生型家蚕杆状病毒、重组病毒BmNPV-VP7分别感染家蚕细胞后培养3～4 d，待细胞发病收集细胞于15 mL离心管中，3 000 r·min-1离心10 min，取沉淀，加入细胞裂解液，冰上裂解30 s，12 000 r·min-1离心10 min，收集蛋白。加2×Loading buffer，100 ℃金属浴10 min。

1.4.2 家蚕样品制备

野生型家蚕杆状病毒、重组病毒BmNPV-VP7分别感染家蚕，喂养6～7 d后，待出现死亡现象。收集家蚕血淋巴，后进行与家蚕细胞样品制备同样的细胞裂解和蛋白电泳步骤。

1.4.3 蚕蛹样品制备

用野生型家蚕杆状病毒和重组病毒BmNPV-VP7分别感染蚕蛹。第7天收集蚕蛹，用研钵研碎后，12 000 r·min-1离心10 min取上清，加入细胞裂解液，冰上裂解3 min，12 000 r·min-1离心10 min。加2×Loading buffer，100 ℃金属浴10 min。

1.4.4 SDS-PAGE分析

先配置12%聚丙烯酰胺凝胶灌入胶板凝固后，配置5%的浓缩胶。等到胶凝固，进行电泳，蛋白Marker上样5 μL，样品上样10 μL。浓缩胶恒压90 V，分离胶100 V，电泳至Loading buffer接近1.0 mm垂直胶板下端即可。电泳结束，染色2 h，再进行脱色，每隔30 min换新的脱色液，直到条带清晰即可。

1.4.5 Western Blotting检测

用甲醇浸泡PVDF膜后，与滤纸一起在转膜Buffer里浸泡15 min以上。电泳结束后将分离胶切割下来，在转膜仪上先放8层滤纸，再放膜，再放胶，再放8层滤纸，2 mA·cm-2恒流电转90 min。结束后，PVDF膜用TBS(5.84 g NaCl与10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl溶于900 mL去离子水，混匀后定容到1 L，调pH到7.4)洗3次，每次摇床上摇10 min。然后用3% BSA(3 g小牛血清白蛋白BSA溶于100 mL TBS)封闭，摇床摇1 h后，4 ℃平置过夜。用TBST(1 L TBS中加入10 mL Tween-20)1∶500稀释的一抗(VP7蛋白的小鼠单克隆抗体)，摇床摇2 h或者4 ℃平置过夜。结束后，用TBST洗涤3次。再用封闭液1∶500稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体)，摇床上摇1 h。用TBST洗涤10 min，3次，再用TBS洗涤，每次5 min。洗完后4 ℃保存在TBS中，最后用ECL显色液进行显色。

1.5 VP7蛋白的ELISA检测方法

1.5.1 家蚕细胞样品制备

用野生家蚕杆状病毒、重组病毒BmNPV-VP7分别感染家蚕细胞。在感染后的2～6 d收集细胞样品，于15 mL离心管中，3 000 r·min-1离心10 min，取沉淀，加入适量细胞裂解液，冰上裂解30 s，12 000 r·min-1离心10 min。取上清分装，分别保存在-20 ℃和-80 ℃冰箱中。

1.5.2 蚕蛹血淋巴样品制备

用野生家蚕杆状病毒、重组病毒BmNPV-VP7分别感染蚕蛹，感染后的第2天开始收集蚕蛹，直接-80 ℃保存，直至第7天。将收集的各个天数的蚕蛹分别用研钵研碎后12 000 r·min-1离心10 min，分别取上清装入15 mL离心管中，加入适量细胞裂解液，冰上裂解3 min，12 000 r·min-1离心10 min。再分别取上清分装入EP管中，每个EP管中装入每次实验所需样品的量，写上标签，一部分-20 ℃保存，另一部分-80 ℃保存。

1.5.3 ELISA检测

取不同天数的细胞样品和蚕蛹样品，用包被液(2.93 g NaHCO3与1.59 g Na2CO3溶于900 mL去离子水再定容1 L)稀释适宜的倍数。每孔100 μL包被酶标板，并设置阴性对照和空白对照，每个样品重复3次， 37 ℃培养箱中温育2 h，再放于4 ℃冰箱中18 h以上。用洗涤液PBST(1 L PBS中加入10 mL Tween-20)洗涤3次并拍干。每孔加300 μL 2% BSA(1 g BSA溶于50 mL PBS中)进行封闭，37 ℃封闭2 h。再用PBST进行洗涤，每孔300 μL，每次5 min，洗3次并拍干。接着每孔加一抗(VP7蛋白的小鼠单克隆抗体，用2% BSA溶液稀释500倍)100 μL，放入37 ℃培养箱1 h。再用洗涤液PBST洗涤3次并拍干。然后每孔加二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体，用2% BSA稀释1 000倍)100 μL，37 ℃温育1 h。结束后用洗涤液PBST进行洗涤，每孔300 μL，每次5 min，洗3次并拍干。再每孔加底物100 μL 37 ℃显色10～15 min。最后每孔加入终止液50 μL，用酶标仪测492 nm的吸光值。

2 结果与分析

2.1 重组病毒BmNPV-VP7的鉴定

经基因测序重组病毒BmNPV-VP7的基因序列与预期序列一致，说明VP7基因已成功插入到家蚕杆状病毒的基因组中。

2.2 VP7蛋白表达的SDS-PAGE与Western blotting分析

Western blotting结果(图1)显示，重组病毒感染的BmN细胞、家蚕血淋巴和蚕蛹样品有且只有在35 ku一处信号带，与轮状病毒VP7蛋白大小相符，野生型病毒感染的样品无信号带，证明轮状病毒VP7蛋白在家蚕细胞、家蚕5龄幼虫以及蝉蛹中成功表达。

A，重组VP7蛋白在BmN细胞中表达的SDS-PAGE与Western blotting分析；B，重组VP7蛋白在家蚕5龄幼虫血淋巴中表达的SDS-PAGE与Western blotting分析；C，重组VP7蛋白在蝉蛹血淋巴中表达的SDS-PAGE与Western blotting分析。M，蛋白质分子质量标准；1，感染野生型病毒家蚕细胞；2，感染重组病毒家蚕细胞。图1 重组VP7蛋白表达的SDS-PAGE与Western blotting分析

2.3 VP7蛋白表达的ELISA检测分析

在家蚕细胞中，如图2中A所示，我们可以观察到，重组病毒感染的家蚕细胞样品的吸光值显著高于对照组野生型病毒感染的家蚕细胞样品的吸光值，说明家蚕细胞表达了VP7基因，且VP7蛋白表达量随时间递增，在第5天达到最大，随后递减。在蚕蛹中，重组病毒感染的蚕蛹样品的吸光值曲线与对照组野生型病毒感染的蚕蛹样品的吸光值曲线差异较大，如图2中B所示，VP7基因在蚕蛹体内得到了表达，且VP7蛋白的表达量随时间递增。第7天从家蚕5龄幼虫血淋巴细胞提取样品，从图2中C可以观察到，在家蚕幼虫中重组病毒感染的家蚕血淋巴样品的吸光值高于野生型病毒感染的家蚕血淋巴样品的吸光值，重组病毒在家蚕幼虫中表达但表达量不高。从实验结果可知，VP7蛋白的表达量与家蚕生物反应器的类型和感染时间有关，家蚕细胞宜在感染后4～5 d提取VP7蛋白，蚕蛹应在感染后7 d提取蛋白，感染7 d后蚕蛹的质量状态会下降，而家蚕5龄幼虫不适宜用作VP7蛋白的表达反应器。这为家蚕生物反应器表达VP7蛋白，制备轮状病毒免疫制剂提供技术指导。

A, 家蚕细胞中重组VP7蛋白表达水平的定量分析；B，蚕蛹血淋巴中重组VP7蛋白表达水平的定量分析；C，家蚕5龄幼虫血淋巴中重组VP7蛋白表达水平的定量分析。图2 VP7蛋白表达的ELISA检测分析

3 小结与讨论

本研究通过基因重组技术构建了VP7蛋白重组家蚕杆状病毒，并在感染重组病毒的蚕蛹、家蚕细胞以及家蚕5龄幼虫中成功表达了VP7蛋白，并比较了VP7蛋白重组家蚕杆状病毒在这三类家蚕生物反应器中的表达量。家蚕杆状病毒表达系统不仅具有表达量较高的优点，而且作为真核表达系统，可对蛋白进行转录后修饰。此外浙江省是家蚕养殖大省，全省桑园面积约5.7万hm2，蚕种年饲养量超过100万张，蚕茧年产量约5万t，有着丰富的蚕业资源[1]。因此，将家蚕作为生物反应器在安全性、有效性和成本等方面具有优势，为A组轮状病毒的疫苗研究提供新的研究思路。以上研究结果为日后深入研究如何大规模制备A组轮状病毒疫苗，并将其商业化生成安全有效的口服疫苗奠定了基础。