不同地域来源桃根癌病病原菌及其致病性鉴定

郝峰鸽，李桂荣，王保全，蔡祖国，尤 杨，牛生洋

（河南科技学院园艺园林学院，河南 新乡 453003）

【研究意义】植物根癌病又称冠瘿病，是由根癌土壤杆菌属（Agrobacterium spp.）中的致病菌所引起的一种世界性病害。病原菌侵染后，感病植株会在根、茎甚至枝条上形成大小不一的瘿瘤，不但影响植株对水分和矿质营养的吸收和运输，同时还使其他病原微生物更易侵染，导致树势衰弱，易感病，果实品质及产量下降，甚至造成植株死亡。【前人研究进展】早期人们根据寄主范围和病害症状将土壤杆菌属分为根癌土壤杆菌、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌及放射形土壤杆菌，认为除放射形土壤杆菌无致病性外其余3种菌都能引起发病。进一步研究认为，土壤杆菌的病害症状是由质粒类型决定的，而非细菌的种类，因而这种以可转移的质粒引发的致病性作为分类依据并不科学。后来，人们又以生理生化特征和致病性特征，将土壤杆菌属直接划分为生物Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3个生物型［1-2］。

带有染色体外的、环状闭合的Ti（tumor-inducing plasmid）质粒是致病的土壤杆菌的共同特征，其上有T-DNA (transfer-DNA)区、Vir区及冠瘿碱分解代谢区与致病过程有关。根癌土壤杆菌可侵染双子叶植物、单子叶植物、裸子植物等多种植物，包括重要的经济作物，尤其以果树中的核果类、浆果类、仁果类和坚果类易感病［3-4］。桃根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的土壤病害，在我国桃栽培区的发病率最高达到90%［3］。【本研究切入点】根癌病菌是土壤习居菌，具有潜伏侵染和系统侵染性，再加之苗木生产和调运中缺乏检疫措施，更加剧了该病害的传播和蔓延［3,5］。

前人对桃根癌病病原菌的研究认为，不同根癌病病原菌对同一寄主的致病性是不同的［6-7］。【拟解决的关键问题】本试验对从不同地区桃根瘤组织中分离，经初步鉴定的根癌病病原菌进行进一步的鉴定，了解病原菌的类型及其致病力，为今后桃根癌病的抗病育种工作及生物防治打下基础。

1 材料与方法

1.1 桃根癌病病原菌及其来源

从我国不同桃产区包括北京平谷、河北昌黎、河北石家庄、山东泰安、江苏南京、甘肃兰州等采集桃树根癌病组织，分离根癌病病原菌，并经初步形态学和致病性分子检测。

1.2 植物材料

指示植物：向日葵（市售）种子浸泡10 h后，置26 ℃培养箱中保湿催芽，萌发后播种于腐叶土∶蛭石∶园土=1∶1∶2的混合基质中培养。

中桃抗砧1号、报春、红根甘肃桃×贝蕾F1、毛桃等4个品种/单株6～10年生植株。中桃抗砧1号自花授粉实生苗（3年生）。

1.3 病原菌的分离、纯化与保存

将完整瘿瘤组织冲洗干净，去除老化表皮，从不同方位选取幼嫩白色的瘤组织2～3块（约2.0 g），75%酒精处理1 min，无菌水冲洗3次；切成2 mm×2 mm的小块，加入1～2 mL蒸馏水，用灭菌玻棒捣碎，在2 mL无菌离心管中浸泡30 min，取100 μL浸泡液涂布于D1M培养基上，28 ℃培养2～4 d。挑取具有根癌土壤杆菌特征的单菌落，划线纯化培养，然后挑取单菌落于液体YEB培养基中，28 ℃、200 r/min 摇床培养约 16 h［8］。

YEB培养基培养的菌液直接放4℃可保存2个月。将菌液与30%的灭菌甘油1∶1混匀，液氮速冻后于-80℃长期保存。

1.4 桃根癌病病原菌鉴定

1.4.1 病原菌致病性的分子鉴定 参照Haas等［9］的方法，对根癌土壤杆菌与T-DNA转移和瘿瘤形成相关的virD2和ipt基因分别进行检测。virD2基因的引物virD2A：5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′；virD2C：5′-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3′，目的条带203 bp。ipt基因引物CYT：5′-GATCG(G/C)GTCCAATG(C/T)TGT-3′；CYT：5′-GATATCCATC GATC(T/C)CTT-3′，目的片段427 bp。

PCR反应体系：50 ng模板DNA（新鲜菌液），1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，0.5 U Ex Taq DNA酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以重蒸水补足20 μL。扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性40 s、55℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经EB染色，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 病原菌致病性的生物学鉴定 （1）3-酮苷试验：将分离纯化后的菌株接种于YEB液体培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养约16 h。培养好的菌液在5 000 r/min条件下离心10 min，用灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1×109CFU/mL。在含有1%乳糖、0.1%酵母浸膏和2%琼脂的培养基上，接种待测菌，28 ℃培养1～2 d。经培养后在平板上倒一薄层Benedict试剂，静置于室温下。如果产生3-酮基乳糖，在菌落的周围出现Cu2O的黄圈，约1 h后黄圈达最大，出现该现象则为生物Ⅰ型。

（2）向日葵接种鉴定：待苗高至5～10 cm时，选取生长健壮、整齐一致的向日葵苗接种。在苗子下胚轴接近子叶的部位，用解剖刀划1 cm长的伤口，在伤口处涂抹一滴菌液（约20 μL），然后用封口膜包裹保湿。每个菌株接种10棵苗。同时接种无菌水作对照。接种后的幼苗放置于28 ℃温室培养。从接种后5 d开始，每天定时观察发病情况。

（3）桃枝条接种鉴定：接种参照Bliss等［10］的方法。在中桃抗砧1号、报春、红根甘肃桃×贝蕾F1等3个品种/单株上，选生长较直立，健壮的新梢，从距枝条顶端10 cm的位置，用解剖刀划1 cm长的伤口，深及木质部，在伤口处涂抹一滴菌液（约20 μL），然后用封口膜包裹保湿，每株菌每个植株上接种3个枝条，每个枝条接种5个位点，位点间间隔约5 cm，同时接种无菌水作对照。单株区组试验设计，设置4个区组。接种后40 d调查，以瘤直径衡量病原菌的致病力。

1.4.3 病原菌16S rDNA序列测定 对经致病性表现最强的3个菌株进一步进行16S rDNA序列测定，以确保试验材料的准确性。引物采用细菌16S rDNA通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′［11］。

细菌基因组DNA提取：取菌液1.5 mL，12 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入0.5 mL蒸馏水，混匀，煮沸10 min，然后用CTAB法提取DNA。

PCR反应体系：80 ng模板DNA，1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Ex Taq DNA 酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以无菌重蒸水补足20 μL。扩增条件：95℃预变性4 min；95 ℃变性40 s、54 ℃退火40 s、72℃延伸40 s，4个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经EB染色，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

将1 500 bp的目的片段用PCR产物纯化回收试剂盒（Biomed）回收目的片断，连接至pMD 19-T载体（TaKaRa），并转化导入DH5α感受态细胞中，在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选。阳性克隆送往上海生工测序，测序结果与GenBank中序列进行同源性比对分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌致病性分子检测

virD2基因参与病原菌侵染寄主的过程，ipt基因是造成寄主植物病症的关键基因之一［9,12-13］，而virD2与ipt基因结合能从不同角度反映病原菌的致病性。两对特异引物在21株病原菌中均出现203 bp和427 bp的目的片段（图1）。说明从不同桃产区分离的根癌农杆菌菌株基本都有致病性，这也是桃树会有大面积发病的原因。

2.2 病原菌的生理生化鉴定

尽管所分离的菌株都有致病性，但分清楚致病菌的生物型，对深入研究其发病机制有重要作用。对21个经初步鉴定具有致病性的菌株进行生理生化鉴定，结果表明，致病菌中主要是生物Ⅱ型，有18株，其余3株菌为生物Ⅰ型（图2）。

2.3 病原菌对指示植物向日葵幼苗的致病性

指示植物接种与分子鉴定相比，需时较长，但能更客观地反映病原菌的致病性。为了验证不同菌株的致病能力，将鉴定为生物Ⅱ型的菌株接种在指示植物向日葵上，结果（图3）表明，21株病原菌均能使向日葵幼苗长瘤，但瘤的大小有差异，即不同菌株对向日葵幼苗的致病能力存在差异。

图2 3-酮苷反应鉴定12株病原菌的生物型Fig.2 Biotypes of 12 strains from peach crown galls identified by 3-Ketolactose test

图3 不同菌株对向日葵幼苗的致病性Fig.3 Virulence of several isolated strains on sunflower seedlings

2.4 病原菌对桃树枝条的致病性

由于指示植物和目标植物在抗病性及对病原菌的应答机制有所不同，在指示植物上有强致病力的菌株还需要在桃树进行最终验证。选择对向日葵幼苗致病力强的10株菌，接种在不同种桃树枝条上，比较其对桃树的致病力。结果（图4）表明，不同植株形成的瘤大小有差异，即不同菌株之间的致病力强弱存在差异，其中菌株AT4-3（生物Ⅱ型）的致病力最强。

图4 AT4-3菌株在桃树及近缘种上的致病情况Fig.4 Pathogenic status of strain AT4-3 on peach trees and other relative species

2.5 病原菌16S rDNA测序鉴定

将包括AT4-3在内的3个菌株的16S rDNA测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对，与根癌土壤杆菌相似性均在99%以上（表1），由此可确定这3个菌株均为根癌土壤杆菌。

表1 AT4-3菌株16S rDNA测序结果同源性比对Table 1 Homologous alignment of strain AT4-3 16S rDNA sequencing results

3 讨论

根癌土壤杆菌中的生物Ⅰ型和生物Ⅱ型是桃及其他核果类的致病菌［2,7-8］。LI等［14］从采自我国5个地区的桃根瘤组织分离的19株根癌土壤杆菌中，鉴定出生物Ⅱ型14株，说明生物Ⅱ型为优势菌群。在同一条件下的桃抗根癌病评价中，生物Ⅱ型致病力强于生物Ⅰ型［15-17］。本试验筛选出的强致病力菌为生物Ⅱ型，这与前人的研究结果一致。

在根癌土壤杆菌致病性鉴定时，分子检测因其快速、简便，得到广泛的研究及应用［9,14,18-19］。分子检测方法大多根据根癌土壤杆菌Ti质粒的Vir区和T-DNA区保守序列设计特异引物，其中Vir区与病原菌附着、T-DNA加工和转移相关，T-DNA区为致瘤区，二者在决定病原菌的致病性时缺一不可。因此，在致病性鉴定时，至少需要Vir区与T-DNA区各一对引物相结合才能确定病原菌的致病性。即使这样，分子检测方法还是有其局限性，比如Vir区，存在大约35个vir基因［12-13］，而一对引物也只能反映出某一个vir基因的存在与否（根据基因区间序列设计的引物除外），因此可能出现假阳性结果。另外，在经向日葵接种鉴定表现为致病性的菌株，在桃上却仍没有表现出病状。这可能是因为指示植物不是该病原菌的自然寄主，不能完全可靠地反映该病原菌对桃的致病能力［20］。

4 结论

本研究对来源于其他实验室（中国农业科学院植物保护研究所）的21株病原菌进行鉴定，为后继的试验提供可靠的材料。生理生化鉴定认为，其中的3株菌为生物Ⅰ型，18株菌为生物Ⅱ型；分子生物学和生物学方法（接种指示植物向日葵）鉴定表明21株菌均具有致病性，但存在致病能力的差异。选择对向日葵致病力最强的10株菌接种桃枝条，发现致病力也有差异。最后，对在桃上致病力表现最强的3株菌进行16S rDNA测序，确定其为根癌土壤杆菌，以其中致病性最强的AT4-3作为后继试验的致病菌。