萝卜叶缘裂刻性状分子标记的开发与应用

张小康，张雪丽，熊秋芳,2

（1.武汉市农业科学院蔬菜研究所，湖北 武汉 430345；2.武汉蔬博农业科技有限公司，湖北 武汉 430060）

【研究意义】叶片是植物进行光合作用、呼吸作用和蒸腾作用的主要器官，影响植物的光合效率、产量及品质等［1］。植物叶片形态由叶形、叶尖、叶基及叶缘等组成，其中叶缘具有全缘、锯齿、裂刻、波浪等形状。叶缘的适度裂刻可改变植株株型，提高群体的通风性、透光性及整个植株的光能利用率，同时在一定程度上抑制病虫害发生，且有利于植物对高温、干旱等逆境的适应性［2］。【前人研究进展】萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是重要的蔬菜作物。植物叶缘裂刻目的性状的定位方面，主要集中在拟南芥和番茄等植物上，而对十字花科萝卜属植物中叶缘裂刻性状的研究还较少［3］。惠麦侠等［4］利用cDNA-AFLP技术，开发了一条与裂刻紧密连锁的SCAR标记用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。邓杰等［5］通过构建白叶缘裂刻BC2DH群体，发现在A03和A10上各存在一个与白菜叶缘裂刻相关的QTL。【本研究切入点】目前关于萝卜叶缘裂刻的分子标记及利用分子标记辅助选择对萝卜叶缘裂刻的育种选择方面均未见报道。【拟解决的关键问题】本试验通过对萝卜裂叶性状的世代调查与统计，研究其遗传规律。同时利用集团混合法（BSA）与AFLP技术相结合筛选与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁的分子标记［6-8］，以此作为萝卜杂交种纯度筛选及其他性状辅助选择的工具之一。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以浅裂材料“武青一号”为母本，全裂叶材料“新洲花叶”为父本杂交得到F1，将F1分别套袋自交和回交，产生F2和BC1。

1.2 性状调查

出苗后30 d左右运用目测法，根据叶型评判标准，对全部单株的叶形表型进行调查记载并统计好各类叶形的单株数目。由于F2组合中植株叶形存在较多中间过渡类型，故将全为裂叶的记录为全裂叶，缺刻少或浅、不明显的记录为叶浅裂。

叶型评判标准：叶浅裂单个叶片面积大，缺刻很少或浅；叶全裂，叶缘呈锯齿状。利用卡方测验分析（χ2）叶缘裂刻遗传规律。

1.3 基因组DNA的提取

采用常用的CTAB方法提取基因组DNA，具体制备方法参照李佳等［9］方法进行。

1.4 基因池的构建

采用集团混合法（Bulked Segregation Analysis，简称BSA［10］），在F2群体中，根据表型分析结果，分别取10个叶浅裂单株和10个叶全裂单株的基因组DNA，将其DNA进行等量混合，构建成叶浅裂DNA池和叶全裂DNA。

1.5 标记筛选

利用AFLP引物组合（EA/MC和EA/MG组合），AFLP接头和引物序列设计均按照VOS等［11］方法进行，引物由武汉天一辉远生物有限公司合成，在亲本与两个基因池间进行筛选。引物组合的序列如表1所示。

在PAGE胶上回收在双亲中产生的AFLP差异片段，放入0.5 mL离心管中，加入20 μL dd H2O，并用一次性无菌枪头捣碎，在95 ℃保温10 min自然冷却，离心后取2 μL上清液为模板重新进行PCR扩增，扩增所用引物及反应条件与AFLP相同。取20 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上检测，将扩增出的目标片段用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术公司）进行回收。操作程序参照该试剂盒说明书。

将两亲本间有差异的引物对，在两个基因池进行PCR扩增，选择在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4，进一步对基因池间各单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘裂刻性状的连锁标记，再对F2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；筛选到与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记引物组合EA1/MC8的片段进行回收、克隆、测序，其中：EA1/MC8引物组合的序列如下：

EA1：5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3’，

MC8：5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3’。

将回收的目标片段连接在pMDT-18 载体上（购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa）。操作程序按试剂盒说明书。选8份转化成功的菌液各吸取100 μL送至武汉天一辉远生物有限公司进行序列测定。剩余400 μL浑浊菌液加400 μL50%无菌甘油在2 mL无菌离心管中于-70℃编号保存。

根据测序得到DNA片段的核苷酸序列，利用Primer Premier5.0软件（http：// www.PremierBiosoft.com）设计引物，引物设计原则为：GC含量为40%～70%，Tm值为60～70，引物内无二级结构，引物间不能相互配对，SCAR引物的正反两个方向长度26 bp，由武汉天一辉远生物有限公司合成，引物DNA序列如下所示。

表1 AFLP引物序列Table 1 List of AFLP primer sequence

正向引物：5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGAT GGAAAC-3’，

反向引物：5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCA TAGGGGG-3’。

1.6 SCAR标记分析

将转化成功的SCAR标记首先在双亲和两个基因池中进行PCR扩增，发现该引物表型出多态性，表明该标记已发展成一个显性的SCAR标记。

2 结果与分析

2.1 裂叶性状的遗传规律

对各个世代的植株叶形观察、统计，结果表明，“武青一号”ד新洲花叶” F1与亲本“武青一号”回交产生的BC1群体中，42株为叶浅裂，39株为叶全裂，x2检验其分离比符合1∶1。F1与亲本“新洲花叶”回交产生的BC1后代87个单株全部为叶全裂（图1）。F1自交获得的F2群体，总株数为241株，其中叶形表现为叶全裂的有185株，表现为叶浅裂有56株，x2检验其分离比符合3∶1（表2）。说明萝卜叶缘裂刻的表型符合显性单基因遗传模式。

2.2 BSA与AFLP相结合分子标记的筛选

从20对AFLP引物中筛选出3对在两个基因池间表现出多态性。将筛选出具有多态性的引物在组成叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池的20个单株基因组DNA中进行验证，进一步分析表明，AFLP引物组合EA1/MC8具有较好稳定性和重现性，该引物组合扩增产生片段大小为251 bp，与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁。

图1 亲本及F1、F2代叶片部生物学表型Fig.1 Leaf phenotypes of parents, F1 and F2 generations

表2 萝卜叶缘裂刻分离群体的表型鉴定Table 2 Phenotypic identification of split population in leaf edge of radish

2.3 SCAR标记验证及分析

将转化成功的SCAR标记首先在双亲和两个基因池中进行PCR扩增，发现该引物表型出多态性，表明该标记已发展成一个显性的SCAR标记，将其命名为HY-18。HY-18标记的特征见表3。

表3 SCAR标记引物对核苷酸序列Table 3 SCAR marker primer pair nucleotide sequence

用SCAR标记引物HY-18对F2群体中241个单株进行扩增，结果185个叶全裂单株中有179个都能观察到此特异带，而6个没有出现该特异带；56个叶浅裂单株中，54个单株不能扩增出该特异带，而2个单株能够扩增出此带（图2）。

表4表明，制备的SCAR标记引物HY-18与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁，可以成功应用于萝卜叶缘裂刻材料的鉴定等辅助选择中。

3 讨论

3.1 裂叶遗传规律

图2 SCAR 标记引物HY-18 扩增结果Fig.2 Amplification results of SCAR Maker primer HY-18

裂叶是作物育种中理想用于性状筛选的形态标记性状，油菜及大白菜方面的研究较多［12-14］。多年来，国内外研究者对白菜、油菜、拟南芥、番茄等其他物种的叶缘裂刻性状遗传进行了研究，萝卜中主要针对肉质根及F1代纯度开展了研究和应用［15-19］。部分研究表明，裂叶性状受1～2对主效基因控制，遗传关系相对简单。因此通过鉴定亲本及F1各单株的苗期叶形就很容易辨别真假杂种，能够提高大田种子纯度，为杂种优势利用提供方便。本试验通过目测法，对萝卜裂叶性状的遗传规律进行研究，通过多个世代的综合分析表明萝卜叶缘裂刻的表型符合显性基因遗传模式，萝卜叶缘缺裂受单个遗传位点控制，全裂叶为显性，叶浅裂为隐性。这与十字花科其他作物研究结果类似［20］。

3.2 裂叶性状的利用途径

传统的萝卜叶形主要分为全缘叶和羽状裂叶，而叶缘裂刻全裂的萝卜叶形是萝卜种质资源多样性的表现，由于全裂叶对全缘叶为显性表现，可以作为萝卜杂交育种中假杂种筛选的辅助性状进行利用。与传统表型选择相比，可在植物生长任何时期不受环境条件影响，且可以排除等位基因互作而造成的干扰，具有快速、经济、高效、准确等优点。

4 结论

本研究结果表明，通过BSA与AFLP技术相结合筛选与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁的分子标记，制备的SCAR标记引物HY-18与萝卜叶缘裂刻基因紧密连锁，可以成功应用于萝卜叶缘裂刻材料的鉴定等辅助选择中。因此，下一步工作是将与萝卜裂叶性状相关的基因进行精细定位和图位克隆，对于揭示萝卜裂叶机理及应用于纯度鉴定和性状筛选都具有重要意义。