睡眠剥夺小鼠海马中BDNF、IL-4变化的研究

张 勇， 宋 赞， 孙晓倩， 张 轩， 薛 蓉， 吴 伟

睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是指由于环境或自身的生理、心理原因所导致的正常睡眠部分或全部丧失的过程和状态。目前应用最多动物睡眠剥夺模型的则是改良多平台水环境法[1](modified multiple platform method，MMPM)。睡眠剥夺可引起情感、认知等多种功能障碍，海马是认知记忆功能维持的重要结构，但睡眠剥夺后海马中细胞因子的动态变化规律的研究相对较少。

为进一步确定细胞因子在睡眠剥夺机制中的作用，本研究选用小鼠MMPM模型，观察BDNF和IL-4的在急性睡眠剥夺的海马组织的动态变化情况，探讨细胞因子BDNF和IL-4与急性睡眠剥夺的关系。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 酶标仪(美国 Bio-Rad公司)。Mouse-IL-4 ELISA Kit、Mouse-BDNF ELISA Kit(上海岚派生物)。

1.2 动物分组 实验动物为雄性C57BL/6J小鼠，共60只，均为6～8 周龄，体重在 20～25 g 之间，经中国医学科学院医学实验动物研究所质量检测合格，并获得天津医科大学总医院伦理委员会的批准。C57BL/6J雄性小鼠经同笼性饲养1 w后随机分为正常对照组(CC)、快速眼球运动(REM) 睡眠剥夺1 d组(SD 1 d)、REM 睡眠剥夺2 d组(SD 2 d)、REM 睡眠剥夺3 d组(SD 3 d)，每组12只小鼠。

1.3 小鼠REM 睡眠剥夺模型的建立 睡眠剥夺室保持光照(9：00～21：00)与黑暗(21：00～次日9：00)交替，光照由 40 W 日光灯照射模拟。室内温度(24±1) ℃，相对湿度 40%～70%。小鼠REM睡眠剥夺模型MMPM建立。睡眠剥夺箱为50 cm×30 cm×30 cm的水箱，均匀地放置8个圆形平台，每次放入6只小鼠，空闲两个平台，小鼠可自由活动。向箱内加入清水至平台下方约1 cm，保持水温20～25 ℃。箱上放置网盖，保证小鼠不能跳出。

实验开始前1 w将小鼠同笼饲养，并在水平台上进行环境适应。SD 1 d 组、SD 2 d组、SD 3 d组睡眠剥夺时间分别为24 h、48 h和72 h。用摄像头观察记录小鼠睡眠剥夺的全过程，小鼠确实存在低头触水而惊醒的反应。

1.4 标本制备 待4组小鼠各自处理完毕后，分别随机取出小鼠，以10%水合氯醛腹腔内注射，剪开胸腔，暴露心脏、肺及肝脏，剪开右心耳，将头皮针插入左心室，头皮针另一端连接预先于4 ℃预冷的100 ml 0.1 mol/L PBS，快速灌注，待灌流出的液体变淡直至清亮无色，此时肺及肝脏变白时提示灌注充分，停止灌注。将小鼠断头后取出脑组织，分离出双侧海马，投入液氮中速冻，然后于-80℃冻存。

1.5 ELISA法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定海马组织匀浆液中BDNF、IL-4表达水平。测定仪器为瑞士infinite M200 Pro 酶标仪。操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 ELISA 法检测不同时长睡眠剥夺小鼠海马中 BDNF表达水平 小鼠海马中BDNF的表达水平方差分析显示SD 1 d组(561.583±25.279)pg/ml较CC组(516.417±24.481)pg/ml升高，差异具有显著性(P=0.029)；SD 2 d组(509.150±31.469)pg/ml与CC组相比稍有降低，但差异并无显著性(P>0.5)，与SD 1 d组相比降低，差异具有显著性(P=0.009)；SD 3 d组(442.650±14.446)pg/ml与CC组相比降低，差异具有显著性(P<0.001)，与SD 1 d组相比显著降低(P<0.001)(见表1、表2、图1)。

2.2 ELISA 法检测不同时长睡眠剥夺小鼠海马中 IL-4表达水平 小鼠海马中IL-4的表达水平方差分析显示SD 1 d组(111.767±4.199)pg/ml较CC组(96.217±3.279)pg/ml升高，差异具有显著性(P<0.001)；SD 2 d组(90.983±2.586)pg/ml与CC组相比稍降低，但差异并无显著性(P=0.13)，与SD 1 d组相比降低，差异具有显著性(P<0.001)；SD 3 d组(75.967±4.227)pg/ml与CC组相比降低，差异具有显著性(P<0.001)，与SD 1 d组相比显著降低(P<0.001)(见表1、表2、图2)。

2.3 Pearson相关性分析显示睡眠剥夺过程中小鼠海马中IL-4、BDNF蛋白表达变化呈正相关性 Pearson相关性分析显示睡眠剥夺过程中小鼠海马中IL-4、BDNF蛋白表达变化呈正相关性，P<0.001，相关系数r=0.863(见图3)。

表1 不同时长睡眠剥夺小鼠海马组织ELISA结果(单位pg/ml)

表2 不同时长睡眠剥夺小鼠海马组织ELISA方差分析

图1 不同时长睡眠剥夺小鼠海马组织BDNF含量

*P<0.05；**P<0.005

图3 不同时长睡眠剥小鼠海马BDNF、IL-4蛋白表达量相关性分析

3 讨 论

急性短时间的睡眠剥夺与饥饿、创伤、缺氧等因素一样，是一种应激源，可造成机体的正常生理紊乱[2]。有实验表明，机体的应激反应可以最终整合到海马区，从而对机体的学习、记忆有着重要的作用[3]。本实验显示，急性睡眠剥夺24 h后小鼠海马中BDNF蛋白表达水平稍有升高，与既往研究[4]显示短时间的睡眠剥夺对导致BDNF水平的上调相一致。可能与睡眠剥夺后体内多种内分泌系统激活，导致诸如多巴胺、去甲肾上腺素等激素上调有关[5]。本实验显示，随睡眠剥夺时间的延长，海马中BDNF水平逐渐下降。睡眠剥夺48 h时蛋白表达水平与对照组相比稍低(差异无统计学意义)；当睡眠剥夺达到72 h时蛋白表达水平较对照组明显降低。BDNF表达的减少，使BDNF对神经元的有益作用减弱，对细胞功能造成影响。BDNF对海马组织有重要的保护作用。BDNF在神经细胞中的作用是通过与TrkB受体和p75受体结合而实现的。BDNF与TrkB受体结合后激活Ras/MEK、PI-3K/AKT、PLCc/PKC和PKA等多种信号传导途径[6]。BDNF的表达减慢了淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠细胞变性的速度，降低细胞变性的程度，减弱Aβ 沉积造成的神经毒性损害[7]。BDNF可引起脑啡肽酶介导的 Aβ 降解，保护神经细胞[8]，通过Neuropep-1外源性上调BDNF表达，可提高TrkB的水平并减少淀粉样斑块的形成[9]。研究表明大脑神经元BDNF表达水平较低的区域，神经元纤维缠结增多[10]。Alzoubi等研究表明SD可以降低BDNF水平并损害记忆[11]。另有研究表明睡眠剥夺对海马细胞增殖的不利影响可能在约48 h之后出现[12]。本研究证明较长时间的睡眠剥夺(72 h)降低了海马中的BDNF水平，这可能是由于机体对睡眠剥夺后的应激反应随着时间的延长逐渐衰减的结果，也有可能是睡眠剥夺造成海马功能损伤导致记忆及认知功能障碍的发病机制之一。

在中枢神经系统中，IL-4主要是由M2表型的神经胶质细胞产生的，IL-4水平的升高表明刺激朝向小胶质细胞M2表型分化[13]。有实验表明，通过暴露于IL-4诱导M2表型，小胶质细胞的iNOS的表达水平显著下调[14]。IL-4可通过调节急慢性巨噬细胞反应发挥神经保护作用[15]。IL-4可以促进小胶质细胞的生长，增强吞噬活性并促进增殖，能抑制一氧化氮(NO)和促炎细胞因子如TNF-α和IFN-γ的产生[16]。IL-4在AD患者脑内的神经炎性反应过程中发挥重要作用[17]。然而，在急性睡眠剥夺时，大脑尤其是海马中的IL-4的变化研究相对较少。本研究显示，24 h的急性睡眠剥夺引起小鼠海马中蛋白表达水平较对照组升高；48 h睡眠剥夺后小鼠海马中的蛋白表达水平与对照组相比无明显差异；当睡眠剥夺达到72 h后，小鼠海马中的蛋白表达水平较对照组降低。本研究显示，随着睡眠剥夺时间的延长，海马中IL-4的水平显示出先升高后降低的变化，这可能表示短时间(24 h)内的睡眠剥夺时，神经胶质细胞向M1表型转化时同样可以部分地向M2表型转化，升高IL-4水平以抵消M1表型引起的负性作用，这可能是机体的自我保护机制；当睡眠剥夺时间延长至72 h时，IL-4水平降低，表明拮抗M1表型分泌的促炎因子的损害作用可能减弱，这造成了一定程度的炎症失衡。有研究表明IL-4缺陷型小鼠表现出明显的认知功能障碍[18]，因此睡眠剥夺造成IL-4动态变化可能是引起认知功能损害的机制之一。

本实验显示，在睡眠剥夺过程中，小鼠海马组织中的IL-4和BDNF蛋白表达量具有相同的先高(24 h)后低(72 h)的趋势，由此，本研究对两者是否具有相关性进行了进一步的探讨。本实验数据的Pearson相关性分析显示，在小鼠睡眠剥夺过程中，海马组织内IL-4和BDNF蛋白表达量存在明显的正相关关系。IL-4与BDNF的相关性在其他疾病的研究中已有证实。在中枢神经系统体外实验中，IL-4的应用引起了BDNF水平升高并促进视网膜神经节细胞的存活[19]；在体内实验中，直接向老年大鼠海马区注射IL-4可引起大鼠海马组织中BDNF水平的上调并改善认知功能[20]。另有实验直接证明，中枢神经系统中的IL-4诱导的M2型小胶质细胞分泌BDNF增加[21]。这些研究均表明，IL-4与BDNF之间具有正相关的关系，IL-4可以促进海马内BDNF的产生，这可能是IL-4产生保护性作用的另一机制。

综上，本实验通过ELISA法证明随着睡眠剥夺时间延长，小鼠海马组织内的BDNF、IL-4呈现先高后低的趋势；睡眠剥夺后BDNF、IL-4表达量的变化可能是睡眠剥夺后造成神经损伤的可能机制之一。