肾纤维化诊断生物标志物研究进展

刘秋玉，刘伟伟，高建东

(上海中医药大学附属曙光医院肾病科 上海中医药大学中医肾病研究所 肝肾疾病病证教育部重点实验室(上海中医药大学)上海市中医临床重点实验室(14DZ2273200),上海 201203)

近年来，慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患病率逐年升高。据报道，中国成人CKD患病率高达13.4%，极大增加了国家的医疗负担[1]。肾纤维化是CKD的标志，CKD的严重程度通常与肾纤维化程度相关[2]。肾纤维化主要包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化和肾内血管硬化，其病理特征表现为肾脏固有细胞损伤、炎症细胞浸润、肌成纤维细胞和成纤维细胞的活化和增殖、细胞外基质(胶原纤维、纤连蛋白、层粘连蛋白)堆积、肾脏固有细胞丢失、肾小管萎缩塌陷和血管稀疏化，最终导致肾脏正常结构破坏。肾纤维化标志着不可逆性肾损伤， 因此早期诊断肾纤维化和针对病因进行治疗是延缓CKD进展的关键。目前，超声和磁共振成像等影像学方法用于评估CKD患者的肾纤维化，但这些技术只能从宏观水平上诊断肾纤维化，无法敏锐地捕捉肾纤维化炎症反应期的微观病变信息。而生物标志物既能评估或定量测量某种疾病的生物学和病理学进程，同时也可作为疾病的治疗靶点[3]。生物标志物参与了疾病进程的各个环节，其水平随着疾病进程的活动或进展程度而不断变化。故确定肾纤维化的最佳生物标志物，有助于早期准确诊断肾纤维化和靶向性防治CKD。现就肾纤维化诊断生物标志物研究进展予以综述。

1 肾脏损伤类标志物

1.1胱抑素 C(cystatin C，CysC) CysC是分子量为13 000的小分子蛋白质，因其分子量小，故可通过肾小球滤过膜。血液中的CysC不易与其他蛋白质结合，只能通过肾脏排泄，而肾小管不能直接分泌CysC，CysC经肾近曲小管重吸收后被完全代谢分解[4]。CysC是评价肾小球滤过功能的良好指标。许洪涛等[5]提出，CysC不但是一个能更准确、更敏感反映早期肾疾病的指标，且在CKD早期诊断与分期中具有重要临床价值。姚卫国等[6]的研究发现，在IgA肾病肾小球硬化大鼠模型中，血/尿CysC 水平与肾小球硬化积分和肾小管间质纤维化积分呈正相关，提示血/尿CysC水平可能是反映IgA肾病肾小球硬化和肾小管间质纤维化程度的可靠指标。

1.2肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)/甲型肝炎病毒细胞受体1 KIM-1属于Ⅰ型跨膜糖蛋白的一种，其由受损的近端肾小管上皮细胞表达。Zhou等[7]的研究表明，在庆大霉素、汞或铬诱导的三种急性肾损伤模型中，与其他近端肾小管的毒性生物标志物(尿素氮、血肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)相比，尿KIM-1具有较高的敏感性和特异性。在临床研究中，尿KIM-1被证实是肾小管损伤的早期诊断指标[8]。此外，KIM-1主要在炎症和纤维化区域内的去分化近端肾小管上皮细胞的腔侧表达，这意味着KIM-1可能在肾小管间质纤维化过程中起作用[9]。

1.3视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein,RBP) RBP是肝细胞产生的低分子量蛋白。临床上，RBP是反映肾近端小管损伤的敏感指标，当肾近端小管损伤时，尿中的RBP明显增多[10]。Pallet等[11]通过连续测量189例肾脏活检患者尿中的低分子量蛋白(RBP、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白)、高分子量蛋白(白蛋白、转铁蛋白、IgG)和总蛋白发现，低分子量蛋白尿水平与肾间质纤维化程度呈正相关，尿RBP与CKD患者的肾间质纤维化程度独立相关。因此，临床可以通过测量RBP水平评估CKD患者的肾间质纤维化程度。

1.4中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) NGAL是分子量为2 500的脂质运载蛋白，其在受损的肾小管中高表达，是急性肾损伤最有效的标志物之一。有学者使用微阵列研究了53个CKD肾活检标本，并用活检标本的微阵列基因表达谱来计算分子评分，结果发现NGAL和KIM-1等的表达水平发生改变，且与肾小管间质纤维化和肾小管细胞损伤的严重程度相关[12]。因此，NGAL和KIM-1可作为预测肾小管间质纤维化和肾小管细胞损伤的生物标志物。

2 炎症和促纤维化因子类标志物

2.1单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 ,MCP-1) 在肾纤维化早期，炎症反应起至关重要的作用。炎症趋化因子，特别是MCP-1，通过聚集炎症细胞，在炎症反应中发挥重要作用。MCP-1不但能检测狼疮肾炎中的间质炎症和纤维化[13]，而且在蛋白尿出现之前，可以检测1型糖尿病肾病早期病变[14]。此外，尿MCP-1有助于评估2型糖尿病肾病患者的肾纤维化程度[15]。Mansour等[16]提出，MCP-1与活检组织中的纤维化有一定的相关性。研究表明，尿MCP-1可以检测到肾功能正常成人早期的肾小管间质纤维化[17]。作为隐匿性肾小管间质纤维化的生物标志物，尿MCP-1对早期诊断和干预肾纤维化具有重要意义。

2.2转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1TGF-β1是公认的纤维化指标，其参与了多种进行性肾病相关的肾纤维化和炎症反应。TGF-β1参与肾纤维化主要有以下几点：①参与炎症反应，调节多种炎症和促纤维化因子。②诱导肾脏固有细胞转分化成肌成纤维细胞，刺激成纤维细胞活化和增殖，促进细胞外基质的产生。③调控基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制物1系统，抑制细胞外基质降解。当发生肾纤维化时，组织、血清和尿液中的TGF-β1水平明显升高。刘江等[18]研究中指出，IgA肾病纤维化患者的尿TGF-β1/肌酐水平与肾小球、肾小管中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原呈显著正相关。因此，尿TGF-β1/肌酐可作为肾纤维化活动性病变的临床检测指标。Kocer等[19]研究证明，在常染色体显性多囊肾病肾纤维化中，血清TGF-β1水平明显升高。Musia等[20]的研究显示，CKD 3～5期患儿血清和尿液中的TGF-β1水平升高。

2.3MMPs/TIMPs MMPs是参与细胞外基质重构的含锌内肽酶，其对组织发育和体内平衡至关重要。最初MMPs被认为仅切割细胞外基质蛋白质，但研究发现细胞黏附分子(钙黏素和整联蛋白)和生长因子及其受体等也是MMPs的底物[21]。而TIMPs是结合和抑制大部分MMPs的内源性抑制剂。研究表明，尿液和血清中的TIMP-1、TIMP-2、MMP-1、MMP-2、和MMP-9是肾纤维化的早期生物标志物[22-23]。此外，Zhou等[24]研究发现，CKD患者的尿MMP-7水平与肾纤维化评分密切相关。在MMP-7基因敲除小鼠中，MMP-7的敲除改善了由阻塞性肾损伤诱导的纤维化病变和基质基因的表达[24]。尿MMP-9是反映移植肾早期和长期功能的生物标志物，MMP-9增加与肾小管萎缩和纤维化有关[25]。在正常情况下，MMPs/TIMPs系统处于稳定状态，一旦失衡将导致细胞外基质沉积，肾纤维化不可逆转。

2.4人附睾蛋白4 (human epididymis protein 4, HE4) HE4是位于染色体20q12～13.1上的基因编码的N-糖基化蛋白。它是促进肾纤维化的新型成纤维细胞衍生因子，也是泛丝氨酸蛋白酶、MMP-2和MMP-9的抑制剂。最初HE4被认为与精子成熟有关，后其被作为上皮性卵巢癌患者的血清生物标志物。Lebleu等[26]发现，HE4在人和小鼠肾脏组织中上调，它通过抑制丝氨酸蛋白酶35和丝氨酸蛋白酶23来防止Ⅰ型胶原的降解，促进肾纤维化。同时他们还发现，编码HE4的基因是肌成纤维细胞中上调最多的基因，而肌成纤维细胞是形成肾纤维化的关键细胞，表明HE4介导了肾纤维化。Wan等[27]发现，CKD肾纤维化患者早期的血清HE4水平明显升高，其血清水平与肾纤维化程度相关，说明HE4可作为早期预测肾纤维化的标志物。

3 微RNAs类生物标志物

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是约20个核苷酸的内源性非编码单链RNA，其在生物体内通过转录后调节机制抑制基因表达。miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡、器官发育、干细胞生物学、肿瘤发生和转移以及免疫系统的功能调节中具有重要作用。其具有组织特异性，并在生物体液中稳定存在。肾脏组织中的miRNAs可以用于肾纤维化的组织学检测[28-29]。目前，miRNAs的定性定量检测变得相对容易，故体液中的miRNAs成为无创生物标志物的理想来源。

CKD以肾纤维化为特征，TGF-β1是肾纤维化的关键因子，它能造成细胞外基质的累积并损害正常的肾功能。TGF-β/Smad3通路在组织纤维化中起重要作用，而miRNAs是TGF-β诱导的肾纤维化的核心成员。在肾损伤期间，TGF-β表达上调并刺激TGF-β1受体，激活Smad3途径，从而调节肾纤维化中miRNAs的表达。目前，用于肾纤维化诊断的miRNAs主要有miR-21、miR-29、miR-192和miR-200[30]。

3.1miR-21 TGF-β1通过Smad3上调miR-21，miR-21通过靶向不同的基因来控制细胞外基质蛋白(胶原蛋白、纤维连接蛋白、上皮钙黏素和α-平滑肌肌动蛋白)的合成，进而调节肾纤维化的进程。正常肾脏中miR-21低表达，但在肾脏疾病患者标本及CKD和急性肾损伤动物模型中，其丰度均大大增加。在梗阻性和糖尿病性肾病小鼠模型中，发生纤维化的肾小管间质和肾小球区域均观察到高表达的miR-21[31-32]。有文献报道，在糖尿病肾病小鼠的肾纤维化中，miR-21通过增加TIMP-1和减少MMP-9，最终导致细胞外基质沉积[32]。Liu等[33]认为，TGF-β调控组织肾纤维化的关键为鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸盐，肾小管上皮细胞中鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸盐与TGF-β活化后的miR-21存在关联，两者共同影响肾纤维化。Glowacki等[34]首次证明，血清miR-21可作为反映早期肾纤维化的一个可靠标志物。

3.2miR-29 在肾纤维化中，除miR-21外，miR-29家族(miR-29a、miR-29b1、miR-29b2、miR-29c)也广泛参与了调控细胞外基质蛋白的生成。miR-29家族对大量的细胞外基质蛋白基因具有靶向作用，从而影响了多种细胞外基质蛋白的表达，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白及原纤维蛋白、MMP-2等[35-36]。在高糖培养基中或在TGF-β1诱导下，人肾脏近曲小管上皮细胞中的miR-29表达下调，且有助于多种胶原蛋白基因的表达。Lv等[37]研究表明，尿外泌体miR-29c可作为CKD患者肾功能和肾纤维化的生物标志物。此外有学者提出，狼疮性肾炎患者尿外泌体中的miR-29c水平与组织学慢性指数和肾小球硬化呈负相关[38]。尿miR-29c与肾慢性程度的相关性，提示其可以用来反映和早期预测组织肾纤维化，是一种新型的非侵入性标志物[38]。

3.3miR-192 与其他器官相比，miR-192在正常肾脏中丰度较高[39]。体内外实验表明，miR-192通过调控E盒结合锌指蛋白1/2参与肾小管间质纤维化[40]。据报道，在阻塞性肾病、IgA肾病和高血压性肾病引起的肾纤维化中，miR-192的表达均上调[41-43]。刘亚楠等[44]的研究表明，miR-192在幼年大鼠单侧输尿管结扎所致的肾间质纤维化模型中表达增加，其可能促进肾间质纤维化的形成。在难治性肾病综合征患者中，尿miR-192水平有助于判断肾小球细胞外基质蓄积及肾间质纤维化的程度[45]。

3.4miR-200 miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)通过抑制E盒结合锌指蛋白1/2和TGF-β2来阻断 TGF-β介导的上皮-间充质转化。在不同的肾纤维化动物模型中，miR-200家族的表达量不相同。有学者在高血压性肾小球硬化患者的肾活检中发现，miR-200a、miR-200b、miR-141、miR-192、miR-205和miR-429在肾内的表达增加，且其上调程度与疾病的严重程度相关[43]。有研究表明，无论导致肾纤维化的是CKD、IgA肾病还是糖尿病肾病，其外泌体miR-200b水平均随肾纤维化的进展而下降，且非近端肾小管来源的外泌体miR-200b是一种更好的肾纤维化生物标志物[46]。

近年来，新的miRNAs生物标志物不断被发现。Lv等[47]研究表明，血清中的miR-130b能作为 2型糖尿病肾病肾纤维化的早期诊断标志物。石变华等[48]的研究显示，在单侧输尿管梗阻大鼠模型中，miR-207在大鼠纤维化肾组织和尿液中表达上调，其为肾脏纤维化的诊断提供新靶点。

4 新型生物标志物

寻找可以精确定量肾纤维化的特异性生物标志物，有助于开发更有前景的肾纤维化治疗方法。目前，已发现多种潜在的生物标志物，但其价值有待进一步研究。B细胞淋巴瘤/白血病-3(B-cell lymphoma/leukemia-3,Bcl-3)通过激活核因子κB通路诱导肾脏细胞免疫应答和细胞炎症反应，参与肾脏纤维化。Chen等[49]研究发现，单侧输尿管梗阻小鼠模型肾组织中的Bcl-3信使RNA和蛋白水平均升高。同时他们还发现，CKD患者血清中的Bcl-3蛋白水平高于正常人，且与血清HE4水平高度相关。Bcl-3参与肾纤维化的机制可能为通过直接与Smad3结合，并保护Smad3蛋白免于泛素化和降解来调节TGF-β/Smad信号转导途径[50]。这些证据表明，Bcl-3可作为检测肾纤维化的新型生物标志物。李晔等[51]发现，新纤维化相关因子表面活性蛋白A2在梗阻性肾组织中高表达，且随着肾纤维化程度加重，表面活性蛋白A2的表达增加，提示表面活性蛋白A2可能参与了肾纤维化过程。Cho等[52]提出，人类肾脏活检标本中的肾间质纤维化及小管萎缩和节段性肾小球硬化与血清Klotho蛋白水平降低相关，提示血清和尿Klotho均能预测肾纤维化。此外，血清半乳凝素-3、骨膜素、盘状结构域受体1、尿波形蛋白信使RNA等也是有广泛应用前景的潜在肾纤维化生物标志物。

5 小 结

CKD多呈隐匿性渐进性进展，初期症状不明显。目前，评估和量化肾纤维化的金标准为肾活检的病理染色，其中Masson三色染色是临床诊断肾纤维化的首选方法，但病理学家主要通过视觉评估Masson三色染色的载玻片进行纤维化量化，缺乏对肾纤维化的标准化评估，具有很大的主观性，且Masson三色染色可能对轻度纤维化不敏感。天狼星红染色和免疫组织化学技术虽能区分不同类型的胶原纤维，但不能敏感诊断炎症反应期的肾纤维化。而生物标志物参与了疾病进程的各个环节，能准确反映疾病的病理特征，它不仅能作为特异性诊断工具，也是疾病的治疗靶点。根据肾纤维化形成的病理机制，从患者样本(组织、血液、尿液)中寻找替代细胞外基质成分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等)的早期生物标志物，有助于早期精确诊断肾纤维化和靶向逆转CKD。未来，借助基因组学、代谢组学和蛋白质组学等新兴技术，筛选出敏感性、特异性高的肾纤维化诊断标志物或联合多种标志物，有望取代经典肾脏病理诊断。