浓缩果汁中游离糖的组成分析

2019-08-27李开曾鸣宋昊王冬

食品研究与开发 2019年16期

李开，曾鸣，宋昊，王冬

（1.北京一轻研究院，北京 101111；2.北京市食品工业研究所，北京 100075）

糖类在植物体的结构和功能方面起着非常重要的作用，不仅是植物生长过程中的能量来源和物质基础，还是糖代谢和基因表达过程中通过糖感知系统调节酶促反应的信号[1-2]。糖类是食品中的主要营养物质，同时对食品的风味、甜味、质构和稳定性有一定的影响，其种类和含量直接影响食品的营养价值。最近几年，我国果汁饮料加工业发展迅速，已经成为了全球最大的浓缩果汁生产国和出口国，浓缩果汁的品质控制显得尤其重要。糖类是浓缩果汁的主要成分，糖类的组成成分影响着浓缩果汁的甜味，同时糖类也是浓缩果汁中可溶性固形物的重要组成[3]，所以监测浓缩果汁中糖类的组成对产品质量的控制有着重要意义。

目前国内外对糖含量的分析方法包括化学法和仪器分析法，化学法有直接滴定法、高锰酸钾滴定法、铁氰化钾法、奥氏试剂滴定法测定食品中的还原糖[4]和总糖，虽然化学法相对便宜、准确度高，但是耗时长、效率低、无法准确定性糖的种类。仪器分析法包括分光光度法[5]、毛细管电泳法（capillary electroph-oresis，CE）[6-7]和色谱法，分光光度法和化学法一样不能确定糖的种类；糖类既不带电，也没有紫外吸收和荧光特性，使用CE 检测糖类化合物需要让糖带电或者衍生化，技术要求较高，操作耗时长，结果重现性较差；色谱法种类较多，主要有离子交换色谱法[8-9]（ion exchange chromatography，IEC）、气相色谱法[10-11]（gas chromatography，GC）和高效液相色谱法[12-14]（high performance liquid chromatography，HPLC），IEC 灵敏度高，但是糖类在电极表面发生氧化还原反应会导致稳定性不够好，另外设备昂贵；糖类化合物沸点高、难挥发、难气化和热稳定差，不能直接用GC 进行分析，需要对样品进行衍生化处理、需用有毒试剂、操作比较复杂、稳定性差[15]；相比之下，HPLC 具有简便、准确、样品前处理容易等优势，因此成为了食品中糖分离鉴定、定量分析的主要手段。由于糖类在紫外可见光区无吸收以及无荧光特性，将二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）和荧光检测器（fluorescence detector，FLD）应用于糖类的检测需要将糖进行衍生化处理[16-17]，这就使分析流程变得复杂，降低了其通用性；相比其他检测器，蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）和示差折光检测器（differential refraction detector，RID）在糖类的分析中应用得最广[18]，虽然ELSD 相对于RID 灵敏度更高、基线更稳定，但是ELSD 更昂贵、操作更复杂，所以在满足定性定量的基本前提下，日常生产过程中糖的检测分析使用RID 更具优势。

本文采用HPLC-RID，建立了快速、准确地分离分析木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的方法，为浓缩果汁中游离糖的检测、监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

配备 G1311C 泵、G1329B 进样器、G1316A 柱温箱和G1362A 示差折光检测器的1260 高效液相色谱系统：安捷伦科技有限公司；HF-2000R 高速离心机：上海利鑫坚离心机有限公司；HC-C18萃取小柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）：上海安谱实验科技股份有限公司。

浓缩桔汁、浓缩橙汁：南充佳美食品工业有限公司；浓缩苹果汁：天水长城果汁集团有限公司；乙腈（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖（含量≥99%）：Sigma-Aldrich LLC.；超纯水（电阻率为 18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Carbohydrate Analysis Column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为 75 ∶25 的乙腈-水；流速为 1.3 mL/min；柱温为 35 ℃；RID 温度为 35 ℃；进样量为 5 μL。

1.2.2 样品前处理

称取样品2 g～5 g，用超纯水溶解，定容至50 mL，然后10 000 r/min 离心20 min，取上清液备用。为了除去样品中可能影响到目标物分析的诸如有机酸、色素等杂质，本文将样品溶液经过C18萃取小柱进行净化处理，首先将C18萃取小柱先用2 mL 甲醇活化，然后用2 mL 超纯水冲洗以去除甲醇，取5 mL 离心后的上清液至萃取小柱，弃去开始的2 mL 流分，收集后续溶液，用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，滤液待分析。

2 结果与分析

2.1 标准物质色谱峰的确定

按照1.2.1 的色谱条件，测定6 种糖的混合标准溶液，得到如图1所示的色谱图，然后分别测定每种糖的标准溶液，确定每种糖的保留时间，最终得到各组分的出峰顺序为木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。

图1 糖标准品的色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the sugar standards

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相比例的选择

改变流动相乙腈和水的比例，其他条件不变（流速为1.0 mL/min，为了保持RID 状态稳定，柱温与RID温度一致为 30 ℃）。分别考察在乙腈/水为 70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20 时对6 种糖的分离效果的影响，得到的色谱图如图2所示。

随着乙腈的浓度增大，分离度逐渐增大，但是保留时间也逐渐增大，峰宽逐渐加大；流动相比例为70 ∶30 时，果糖和葡萄糖没有完全分离，峰形较差，随着乙腈比例的增大，分离效果变好，75 ∶25 时完全分离，并且峰形都较好，如果继续增大乙腈的比例，峰的展宽加重且分离时间变长。综合分离时间与分离度，选择75 ∶25 为流动相比例。

2.2.2 测试温度的选择

柱温是色谱分析的一个重要参数，直接影响化合物的分离度和分析速度。为了考察柱温对分离6 种糖的影响，保持流动相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、流速（1.0 mL/min）不变，控制分析温度为 25、30、35、40 ℃，分离结果如图3所示。

图2 不同流动相比例时糖标准溶液的色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the sugar standards in different volume ratios of the mobile phases

图3 不同分析温度时糖标准溶液的色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed in different temperatures

随着温度的升高，各化合物的保留时间逐渐变短，但是分离度和保留时间变化都不是太明显，综合考虑选择35 ℃为分析温度。

2.2.3 流速的选择

根据van Deemter 速率理论方程式H=A+B/u+Cu（A、B、C 为常数，H 为理论塔板高度，u 为流动相线速度），在一定范围内，随着流速的降低，H 降低、柱效升高、分离度变大，但是流速过低时，分析时间变长、柱效反而降低；提高流速可以缩短分离时间，但是流速过高时，待分析化合物来不及分离就被洗脱出，柱效就会降低，分离效果变差。保持流动相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、温度（35 ℃）不变，考察流速为 1.0、1.3、1.5 mL/min 时6 种糖的分离情况，如图4所示。

图4 不同流速时糖标准溶液的色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed on different flow rates of the mobile phase

在3 种流速下，6 种糖的分离效果都较好，随着流速的升高，分析时间显著缩短。另外，流速升高增大，柱压会随之升高，会影响色谱柱寿命，从1.3 mL/min 到1.5 mL/min 分析时间差别较小，所以最终确定1.3 mL/min为流动相速度。

2.3 样品前处理

浓缩果汁的组成非常复杂，含有糖类、色素、酚类和有机酸类等化合物，色素、酚类和有机酸类化合物的疏水性比糖类化合物强，容易吸附在色谱柱上不被洗脱，长期这样会降低色谱柱的柱效，缩短色谱柱的寿命，所以正式分析前应对样品进行净化处理。HCC18萃取小柱的填料具有较高的疏水性，糖类化合物在柱子上很难保留，而色素等干扰物质相较于待测化合物的疏水性强、在柱子上保留强，从而可以净化样品溶液。浓缩苹果汁样品净化前后的对比效果见图5，经固相萃取后色素去除完全，待测化合物的峰形、峰面积没有影响，柱压明显降低，说明该方法能简单快速净化果汁待测样品。

图5 样品处理前后的效果Fig.5 The results before and after treatment of samples

2.4 方法的验证

配制6 种糖的一系列浓度标准溶液，按照优化过的分析条件进样测试，同一浓度分析3 次，对峰面积（y）和浓度（x）进行拟合，得到6 种糖的线性方程和相关性系数（如表1所示），线性范围较宽，R2＞0.999 0。

表1 方法的线性方程Table 1 Linear equations of six sugars

为了研究方法的重现性，按优化后的色谱条件，将6 mg/mL 的标准溶液连续进样6 次，分别计算每种化合物保留时间（tR）和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2，tR的 RSD 为0.05%～0.07%，峰面积的RSD 为0.77%～4.54%；另外，为了研究方法的稳定性，连续6 d 对6 mg/mL 的混合标准溶液测试，分别计算每种化合物的tR和峰面积的 RSD，结果见表2，tR的 RSD 为 0.41%～1.75%，峰面积的RSD 为1.39%～2.99%。以上结果说明方法重现性良好并具有较好的稳定性，这可能是由于糖溶液比较稳定、在不同日期检测其含量波动较小[19]。

表2 精密度试验结果（n=6）Table 2 Results of the precision experiments（n=6）

为了检验方法的准确度，以浓缩苹果汁为基质进行加标回收试验，向浓缩苹果汁中加入24.575 mg/g 和48.750 mg/g 的混合标样，然后根据优化后的条件进行测试，平行分析3 次，结果见表3。

6 种糖的回收率在87.20%～105.22%，证明该方法准确性较好。通过以上线性范围、精密度和回收率结果可知，该方法准确可靠，能满足浓缩果汁中糖类定性定量分析的要求，可以用于浓缩果汁品质的控制。

2.5 实际样品测定

采用优化后的条件对3 种浓缩果汁进行分析，根据保留时间对样品的色谱峰进行定性，色谱图见图6。测定结果见表4，浓缩苹果汁、浓缩桔汁和浓缩橙汁中都只检出果糖、葡萄糖和蔗糖。其中，浓缩苹果汁中，果糖含量＞葡萄糖含量＞蔗糖含量；而浓缩桔汁和浓缩橙汁中蔗糖含量＞果糖含量＞葡萄糖含量，柑橘汁中葡萄糖与果糖的含量比值基本上保持在0.85 与1 之间，这个指标可以作为识别浓缩柑橘汁的真伪[3，20]，本文中被测浓缩桔汁和浓缩橙汁这个指标分别为0.95 和0.90。