蜂蜜中糖类的高效液相色谱测定及其在蜂蜜品质控制中的应用研究

张晓华

（许昌学院食品与生物工程学院河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南许昌461000）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经巢脾转化、脱水、贮存酿造而形成的天然甜物质。其中，葡萄糖和果糖的含量在蜂蜜中所占比例高达65%～80%，蔗糖的成分相对较少不超过8 %，另外，水分达到20 %左右，其余的物质包括：蛋白质、多酚、黄酮类化合物、酶、游离氨基酸、色素、生物碱、维生素和香气化合物等，大约占5%。蜂蜜中的相关成分会随生长环境，水分浓度，天气温度等因素影响而不同[1-2]。

蜂蜜中的许多物质为人体代谢所必需物质，具有很高的营养价值受到越来越多消费者的青睐，且市场需求量很大[3]。部分生产企业在利益的驱使下，利用各种掺假方式大量生产制造假蜂蜜，牟取暴利[4]。目前蜂蜜的掺假方法可以概括为两大类：（1）以假充真，利用白糖熬制假蜂蜜，或者利用果葡糖浆、高果糖浆、淀粉糖浆、甜菜糖浆、大米糖浆等进行掺假，尤其是果葡糖浆。因为蜂蜜中的主要成分就是葡萄糖和果糖，而果葡糖浆的葡萄糖和果糖比例与蜂蜜中葡萄糖和果糖的比例十分相似，利用果葡糖浆掺假的蜂蜜检测指标完全达到国家标准，甚至更高。（2）以次充好，杂花蜜的口感、营养价值等均比不上单花种蜂蜜。所以市场上常常存在以低价的杂花蜜掺入单花蜜的问题蜂蜜。同时，也有将价格相对低廉的单花蜜掺入高价单花蜜的冒牌蜂蜜的存在[5]。综上所述，蜂蜜的掺假技术多样，且具有不可预见性。

目前，蜂蜜品质控制检测方法除了国家标准或行业标准以外，还包括一些文献叙述方法[6-8]，例如：花粉检验法、光谱法、色谱法、质谱法、酶法等。上述方法总结起来共分为3 类：（1）传统的检测手段，包括感官识别，理化指标检测和花粉检验法等。这类方法大部分只能用于初步判断，不能进行准确检测。（2）利用大型仪器（例如多级质谱等）[9-11]，对蜂蜜样品的相关指标进行全面分析，实现真假鉴别。该类方法使用的仪器价格相对昂贵，测定时间较长，国内许多实验室和公共事业单位承担不起昂贵的购置费用，和较高的运行维护和检测费用。同时，为了得到较为准确的分析结果，通常需要较长的流出时间和复杂的流动相条件来完全分离各个目标分析物。这会消耗较长的时间和使用大量的有机溶剂，而且，分离效果的好坏与背景基质的复杂程度有较强的依赖性。（3）色谱法或光谱法结合化学计量学一阶校正方法[12-18]：主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）、支持向量机、电子鼻、电子舌等，进行建模分析。这种基于光谱信息的二维模式识别方法，由于其潜在的缺陷，往往具有一定的局限性，得到的结果是各个组分真实光谱的线性组合，所以其解不具备相关的物理意义。另外，利用化学计量学方法进行建模、聚类分析，需要具备一定的化学计量学基础才能够开展，对于非化学计量学工作者是一个令人头疼的问题。

以上现有的每种检测方法都有一定的局限性，且现行检测手段大多都是在掺假方式出现以后相应展开的，也就是说检测手段落后于掺假手段。受花源和一些环境因素（如土壤、季节、温度和气候）等的影响，蜂蜜中糖类物质的含量存在一定的差异[19]。本论文综合考虑了方法的准确性和实用性，本着优势互补、高效、经济和环保的原则，巧妙地将蜂蜜中的主要物质糖类的含量与蜂蜜品质控制联系在了一起，结合“简单聚类分析”，对蜂蜜品质控制方面拟进行探索性研究。糖类物质分子结构中不存在生色基团，采用紫外衍生或荧光衍生方法对其直接检测较为困难[20]。为加大灵敏度和分辨率，文章在现有方法的基础上，利用高效液相色谱结合示差折光检测器对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖5 种糖类进行定性定量分析，然后结合定量结果，利用“简单聚类分析”方法进行蜂蜜的产地溯源和掺假鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9 种蜂蜜均为中国知名品牌，从周边超市及网上采购所得。

5 种标准物质（果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖）均为色谱级别。果糖和乳糖：大连凯美化工工程配套有限公司；蔗糖和麦芽糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡糖糖：北京北纳创联生物技术研究院；果葡糖浆：上海好成食品发展有限公司。乙腈（色谱级）：美国飞世尔公司；所用纯水为超纯水仪Mini12UV制备得到。

标准品、果葡糖浆和蜂蜜在4 ℃下密封保存。

1.2 仪器与设备

1260 型高效液相色谱仪结合示差折光检测器：美国安捷伦科技有限公司；Mini12UV 型超纯水仪：Kertone 公司；XW-80A 型旋涡混合器：其林贝尔仪器制作有限公司；US6180DH 型超声波清洗器：北京优晟联合科技有限公司；MS205DU 型电子天平：上海梅特勒托利多仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

所用的高效液相色谱系统是Agilent 1260，色谱柱为 ZORBAX 氨基分析柱（4.6 mm×150 mm），流动相为乙腈∶水（25∶75，体积比）。操作条件为：柱温 40 ℃；流速1.0 mL/min；进样量 10 μL。示差折光检测器温度：40 ℃。

1.3.2 标准溶液的配制

糖的标准贮备液制备：用电子天平分别称取一定量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准品，用超纯水定容至刻度线，混匀。

标准溶液制备：将储备液进行梯度稀释为工作液，工作液现用现制，利用工作液制备标准溶液，每种分析物标准曲线的浓度是在其线性范围内随机设计。

1.3.3 掺假蜂蜜的制作方法

果葡糖浆和枣花蜂蜜以1 ∶1（质量比）比例混匀，震荡，超声加热30 min，使其溶解均匀。使用0.45 μm滤膜过滤，再注入色谱系统。每个样品进行重复分析，并根据样本序号随机进行试验。

1.3.4 蜂蜜样的配制

选取3 种蜂蜜，分别为枣花蜜、洋槐蜜和椴树蜜。每一种蜂蜜随机选取了3 个产地。枣花蜜的产地为江西、湖北和上海；洋槐蜜的产地为：江西、河南和上海；椴树蜜的产地为黑龙江、吉林和上海。每一种蜂蜜称取不同的质量到10.0 mL 的棕色容量瓶中，并用流动相稀释至刻度。每个类型的蜂蜜构建4 个蜂蜜样本。所有的样本均超声处理30.0 min，使其溶解均匀。使用0.45 μm 滤膜过滤，再注入色谱系统。

2 结果与讨论

2.1 5种糖类色谱行为分析

5 种标准物质的示差折光检测色谱图见图1。

图1 5 种糖类标准物质的示差折光检测色谱图Fig.1 The elution time profiles by using differential refraction detector for five analytes

由图1可知，在设定的高效液相色谱法的条件下，5 种糖类物质能完全分开，而且分离效果相对较好，周围没有其他峰干扰，表明此色谱条件适合蜂蜜中5 种糖类的测定。5 种糖类的出峰时间分别为：果糖4.53 min、葡萄糖5.15 min、蔗糖6.96 min、麦芽糖8.23 min、乳糖9.18 min。

试验以标准溶液的浓度作为横坐标，峰面积作为标准曲线的纵坐标，对5 种糖类的线性回归方程进行分析，结果如表1所示。

表1 5 种糖类标准品的线性相关性Table 1 The linear correlation of five sugar standards

5 种糖类的线性相关系数处于0.995 8～0.999 0 之间，线性关系良好，能够很好的满足本试验定量分析的要求。

2.2 基于蜂蜜中5种糖类的定量分析结果，进行蜂蜜品质控制分析

2.2.1 蜂蜜产地溯源分析

根据建立的标准曲线方程，对3 个省份洋槐蜂蜜中的5 种糖类进行定量分析，所得结果如表2所示。

表2 洋槐蜜中5 种糖类的定量结果Table 2 The quantitative results of five sugars in acacia honey

从表2可以看出，不同产地的洋槐蜂蜜，5 种糖类的含量不尽相同。其中，相对果糖、葡萄糖和蔗糖而言，麦芽糖和乳糖含量相对较低。江西省和河南省的洋槐蜂蜜中未检出乳糖。果糖含量河南省洋槐蜜最高，葡萄糖含量上海市最高，蔗糖含量江西省最高。

对于枣花蜜，随机采集了3 个省市，包括江西省、湖北省和上海市。所得到的5 种糖类的定量结果如表3 所示。

表3 枣花蜜中5 种糖类的定量结果Table 3 The quantitative results of five sugars in jujube nectar honey

从表3可以看出，对于枣花蜜而言，5 种糖类的含量也不尽相同。其中，蔗糖的含量3 个省份差别最大，约为68 倍。因此，糖类的含量分析，可以看作是一种用于区分蜂蜜产地非常有用的方式。

椴树蜜中的5 种糖类的含量见表4。

表4 椴树蜜中5 种糖类的定量结果Table 4 The quantitative results of five sugars in linden honey

由表4可知，与上述两种蜂蜜不同的是，3 个产地的椴树蜜中果糖和葡萄糖含量相差不大。对于椴树蜜，3 个产地中，蔗糖含量相差较大，约为77 倍，其他4种糖类也存在不同的差别。

基于表2、表3和表4的定量结果，本文利用蜂蜜中含量较高的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，对所研究的3 种蜂蜜（洋槐蜜、枣花蜜和椴树蜜）的产地进行区分，区分效果见图2。

图2 蜂蜜产地区分效果图Fig.2 The classification of different places honeys

从图2可以看出，同一蜜源、不同产地的蜂蜜自动聚集为不同的组，同一产地同一蜜源蜂蜜样本聚集为一组。对于每一种蜂蜜，12 个研究样本自动聚集为3组，分别对应于本工作中所检测的3 个产地的蜂蜜样本，实现了蜂蜜产地的成功区分，结果令人满意。研究结果将为蜂蜜的产地溯源提供新的方法，对于蜂蜜质量监控具有一定的实际意义。

2.2.2 蜂蜜种类的区分

基于果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，对上海市的3 种蜂蜜（洋槐蜜、枣花蜜和椴树蜜）尝试进行了种类区分，区分效果见图3。

3 个蜜源种类的蜂蜜自动区分为3 组，正方形的符号代表洋槐蜜，六边形的符号代表枣花蜜，菱形代表椴树蜜。3 种蜂蜜区分效果较好，说明该种方法可以推广尝试应用于不同蜂蜜种类的区分，对于蜂蜜的品质控制具有一定的理论意义和实际意义。

2.2.3 蜂蜜掺假鉴别分析

真蜂蜜和果葡糖浆掺假蜂蜜中5 种糖类的检测结果如表5所示。

图3 蜂蜜种类区分效果图Fig.3 The classification of different floral honeys

表5 枣花蜜和掺假枣花蜜中5 种糖类的定量结果Table 5 The quantitative results of five sugars in jujube nectar honey and adulteration honey

因果葡糖浆的主要成分为葡萄糖和果糖，所以果葡糖浆掺假蜂蜜中检测得到的果糖和葡萄糖的含量均高于枣花蜜，而其他糖类的含量较枣花蜜低。我们可以基于真蜂蜜和果葡糖浆掺假蜂蜜中糖类含量的不同进行掺假鉴别。

利用枣花蜜和果葡糖浆掺假枣花蜜中蔗糖、果糖和葡萄糖含量的不同进行真假蜂蜜的区分，效果图见图4。

图4 蜂蜜掺假鉴别效果图Fig.4 Discrimination of adulterated honeys and real ones by the content of sugars

从图4可以看出，假蜂蜜和真蜂蜜自动聚集为不同的组，白色星型符号代表真的枣花蜂蜜，黑色星型符号代表果葡糖浆掺假枣花蜂蜜，区分效果十分明显。该方法可以为解决目前蜂蜜市场上掺假造假问题提供一定的参考和指导。

3 结论

本研究方法在现有方法的基础上，综合考虑了方法的准确性和实用性，在不需要借助大型仪器的情况下，成功实现了蜂蜜品质的鉴别分析。本论文基于蜂蜜中5 种糖类的定量结果，构建了三维立体图形，结合类似化学计量学中的“聚类方法”进行综合分析，其中，不同种类、产地和掺假蜂蜜自动聚集为不同的组，可以很直观的进行区分。该方法基于一种巧妙的构思，使用者不需要具备化学计量学知识，也可以轻松进行简单“聚类”，对蜂蜜的品质控制进行了有效分析。从试验结果可以看出，该方法可行有效，不同种类、不同产地以及掺假蜂蜜都能进行很好的区分。本研究方法操作简单易行，而且可以节约时间和检测成本，减少有害有机溶剂的用量，是一种绿色环保、简单可靠的方法，且具有普遍使用性，能很好的推广使用。