拟南芥内膜Na+,K+/H+反向转运体研究进展

王立光

拟南芥内膜Na+,K+/H+反向转运体研究进展

王立光

甘肃省农业科学院 生物技术研究所，甘肃 兰州 730070

拟南芥内膜Na,K+/H+反向转运体 (Endosomal NHX) 的亚细胞定位、离子转运特性及生物学功能阐释取得了重要进展。拟南芥内膜Na+,K+/H+反向转运体包含AtNHX5和AtNHX6两个成员，它们的氨基酸序列相似性为78.7%。研究表明，AtNHX5和AtNHX6具有功能冗余，它们都定位在高尔基体 (Golgi)、反面高尔基体管网状结构 (TGN)、内质网 (ER) 和液胞前体 (PVC)，参与调控耐盐胁迫、pH平衡和K+平衡等。有报道显示内膜NHXs跨膜结构域存在能够调控自身离子活性的酸性保守氨基酸残基，对其自身功能具有决定性作用。最新研究结果表明，拟南芥内膜NHXs影响囊泡运输和蛋白存贮，并参与生长素介导的植物生长和发育。文中主要对拟南芥内膜NHXs的亚细胞定位、离子转运、功能及应用进展进行了概述。

内膜Na+,K+/H+反向转运体，亚细胞定位，离子转运，囊泡运输，蛋白存贮

Na+,K+/H+反向转运体 (NHX) 是一类跨膜反向转运蛋白，属于一价阳离子/H+反向转运体 (Cation/proton antiporter，CPA) 基因家族中的CPA1亚家族，它们在酵母、细菌、植物和动物等生物体内广泛存在，生化活力是将Na+或K+与质子 (H+) 进行跨膜反向转运[1-4]。植物内，质膜H+-ATPase (P-ATPase)、液胞膜H+-ATPase (V-ATPase) 和H+-PPiase产生H+电化学势梯度，为Na+,K+/H+反向转运体的离子转运提供驱动力[5-8]。大量研究表明，维持细胞内离子和pH稳态对细胞活动和功能至关重要，而植物Na+,K+/H+反向转运体是植物细胞的重要跨膜反向转运蛋白，对维持离子和pH平衡具有重要作用，并在各种细胞过程中扮演重要角色，包括逆境响应、膜微囊运输、蛋白存贮、细胞生长、渗透调节、Na+和K+离子运输及生长与发育等生理生化过程[9-20]。

植物NHX在细胞内广泛分布，并多以多基因家族形式存在。植物中NHX最先由Ratner于1967年从大麦质膜上发现，液胞膜上的NHX活性于1985年第一次在甜菜贮藏组织中检测到[21-22]。后来，人们相继在多种植物内检测到液胞Na+,K+/H+反向转运活性，并展开了深入研究。但是，第一个被克隆到的成员是Gaxiala于1999年在拟南芥cDNA文库中获得的[23]，随后众多基因在植物中被鉴定克隆出来。

根据亚细胞分布，植物Na+,K+/H+反向转运体基因家族成员被分为3类，即质膜NHXs (Plasma membrane NHX)、液胞NHXs (Vacuolar NHX) 和内膜NHXs (Endosomal NHX)[3]。已有研究已经证实，质膜和液胞NHXs可以逆着Na+和K+浓度梯度运输，将细胞质内的Na+和K+外排出细胞或区室化到液胞内，降低细胞质的渗透势，避免水分胁迫[21]。在盐胁迫条件下，液胞NHXs对细胞质和液胞中pH值的调控起着重要作用[24]。通过Na+,K+/H+反向转运体氨基酸序列分析发现，Na+,K+/H+反向转运体的N端是负责转运的区域，C端含有多个蛋白激酶作用位点，是活性调节区域，在离子选择性方面起着重要作用[25]。模式植物拟南芥中NHX基因家族包含8个成员，其中质膜NHXs (AtNHX7/SOS1、AtNHX8)、液胞NHXs (AtNHX1–4) 研究得较早，并且AtNHX7/SOS1的调节机制研究得最为清楚。研究表明，AtNHX7/SOS1的表达和蛋白活性受蛋白激酶AtSOS2/CIPK24调控，而AtSOS2/CIPK24的活性又受Ca2+感受蛋白AtSOS3/CIPK4的调控，当AtSOS3/CIPK4与AtSOS2/CIPK24形成复合体，通过磷酸化去除AtNHX7/SOS1的C端自抑制区，从而将其激活[26-30]。而液胞膜上Na+,K+/H+反向转运体很可能受到CBL-CIPK信号通路调控[31-32]，但具体的研究还未见报道。通过生物技术，在拟南芥、烟草、甜菜、绿豆、花生及马铃薯等植物中转入拟南芥质膜或液胞NHXs成员可以明显提高这些植物的抗盐、抗旱及钾营养代谢能力，有望获得新的抗逆材料[33-36]。

拟南芥内膜NHXs基因 (AtNHX5和AtNHX6) 虽然早已被发现，但研究开展相对滞后，近几年才取得重要进展[9,37-38]。文中根据已有的报道，结合其他植物类似基因的研究成果，对拟南芥内膜NHXs的亚细胞定位、调节离子与pH平衡、蛋白运输及植物生长发育中的作用机制及其应用的研究进展等方面进行了综述。

1 AtNHX5和AtNHX6的亚细胞定位及基因表达

拟南芥质膜NHXs (AtNHX7、AtNHX8) 和液胞NHXs (AtNHX1–4) 的亚细胞定位先后被报道，证明分别位于质膜和液胞膜上[33,39-43]，而拟南芥内膜NHXs (AtNHX5、AtNHX6) 的具体亚细胞定位在相当长的时间内未见报道，只被认为是存在于质膜和液胞膜间的内膜上[3]，直到2011年Bassil等通过带有荧光蛋白标签的SYP32、VHA-a1和SPY61蛋白与AtNHX5、AtNHX6进行共定位分析，并通过免疫电镜技术对AtNHX6亚细胞定位进行分析，首次报道AtNHX5和AtNHX6定位在高尔基体和反面高尔基体管网状结构[44]。王立光等通过对AtNHX5-GFP和AtNHX6-GFP与带有荧光蛋白标签且位于高尔基体的SYP31、MEMB12及位于反面高尔基体管网状结构的SYP41、VTI12的蛋白进行共定位分析也证实了AtNHX5和AtNHX6在高尔基体和反面高尔基体管网状结构存在[15]。Reguera等通过进一步研究NHX5-YFP与反面高尔基体管网状结构marker VTI12-RFP、液胞前体 (Prevacuolar compartment) Marker ARA7-RFP和Rha1-RFP发现，AtNHX5虽然主要存在于反面高尔基体管网状结构，但在液胞前体也有分布，AtNHX5很可能在反面高尔基体管网状结构和液胞前体间穿梭，这是通过囊泡运输实现的[17]。最新研究成果进一步扩大了AtNHX5和AtNH6的定位范围，利用内质网(Endoplasmic reticulum) Marker mCherry-HDEL进行共定位分析表明，在内质网上存在内膜NHXs分布[19]。以上研究成果表明，在质膜和液胞膜之间的内膜系统中，AtNHX5和AtNHX6广泛存在，已经证实存在于亚细胞结构高尔基体、反面高尔基体管网状结构、内质网和液胞前体。目前，虽然未见AtNHX5和AtNHX6存在于内膜系统其他部位的报道，但也不能排除其存在的可能性，因为AtNHX5和AtNHX6很可能是随着囊泡运输穿梭于这些膜结构。在其他植物中，内膜NHXs的亚细胞定位研究进行得较少，远低于拟南芥内膜NHXs，但早在2008年Rodriguez-Rosales等通过在洋葱表皮表达LeNHX2-GFP发现，番茄内膜LeNHX2在液胞和细胞核周边的泡状结构上存在，但进一步的亚细胞定位却未见报道[45]。拟南芥内膜NHXs的亚细胞定位成果将为其他植物中已鉴定的类似反向转运体的定位提供依据和指导。

Yokoi等研究表明，在生长21 d植株的根和茎中，通过Northern blotting能检测到低丰度mRNA，而检测不到mRNA，只有通过灵敏度更高的RT-PCR技术检测到基因表达[39]，这表明基因表达在根和茎中应低于基因表达。Bassil等通过实时荧光定量PCR对和基因表达情况进行检测发现，在花、花蕾、茎、莲座叶和根中2个基因都有表达，且除了果荚中的表达低于外，在其他部位的整体表达水平略高于[44]。王立光等对整株幼苗基因表达检测发现，在植株抽薹前，随着幼苗生长，和的相对表达含量升高，且的整体相对表达明显高于[15]。Ashnest等克隆基因上游3 kb的启动子，通过GUS基因检测启动子活性及表达情况发现，启动子在成熟胚、从早期到晚期发育的鱼雷胚及萌发后的弯曲子叶中驱动GUS明显表达[46]，预示着在这些阶段和部位AtNHX6启动子活性高，基因表达明显。Dragwidge等进一步对启动子活性研究发现，在主根顶端和侧根原基，GUS被明显启动表达，这进一步表明内膜在根组织中表达[18]。内膜基因的表达研究也在番茄、水稻和胡杨中展开，并进行了报道。Venema等通过Northern blotting分析发现番茄基因在根和茎中强表达，而在叶中表达较弱[47]。Fukuda等对水稻基因启动子研究发现，在侧根发生部位、维管束、水孔、根尖和花粉粒等处检测到GUS表达[48]，说明该基因启动子在这些部位活性较强，也暗示基因在这些部位表达。叶楚玉等克隆了胡杨中的内膜NHX基因，通过实时荧光定量PCR分析发现，在根、茎和叶中都检测到该基因的表达[49]。这些结果与拟南芥和基因表达有很多相似之处，为拟南芥内膜NHXs基因的表达研究提供了基础。

2 AtNHX5和AtNHX6影响生长素介导的生长发育

Shi等研究发现，过表达不但提高了夏瑾叶片外植体的再生率，还提高了再生植株移植到土壤中的成活率，转入并表达基因的夏瑾比野生型开花提前，生长发育受到影响[50]。通过AtNHX5和AtNHX6的氨基酸序列比对发现，两者存在很高的相似性，相似率达到78.7%，单独敲除两者中的任何一个都不能对植株生长和发育造成影响，但是同时将两个基因敲除，双突变植株表现出生长迟缓、发育受阻及植株矮小，通过电镜切片进一步发现双突变植株细胞数目变小、细胞体积变小[44]。王立光等和武学霞等也分别发现AtNHX5和AtNHX6同时缺失的双突变植株矮小、莲座叶变小、结实率降低[15-16]。最新研究发现，AtNHX5和AtNHX6可能通过它们的运输活动产生的pH值梯度调节生长素穿越内质网的运输，从而参与生长素介导的生长发育[19]。同时，Dragwidge等证明AtNHX5和AtNHX6通过改变质膜上PIN蛋白丰度介导了植物生长发育[18]。以上结果表明，AtNHX5和AtNHX6在细胞增殖和扩展等过程中起到重要作用，调节着植物的生长发育，其调节机制是通过影响生长素而实现的。在番茄中，也有对LeNHX2相关功能的研究，Rodriguez-Rosales等通过RNA干扰技术对番茄的进行沉默，发现随着干扰程度加强，植株生长受到的抑制作用也随着加强，果实和种子产量逐渐降低，但作者的研究并未涉及是否通过生长素介导[45]。

3 AtNHX5和AtNHX6调节胞内离子和pH平衡

拟南芥质膜NHXs和液胞NHXs介导Na+、K+的转运及调节pH平衡的功能已被证实[28,33,40,51-52]，那内膜NHXs是否具有相似的功能呢？根据这些问题，针对内膜NHXs相关功能的研究先后展开，并取得了重要的进展。Yokoi等在酵母突变体AXT3K转入AtNHX5基因，首先发现转基因酵母能通过增加离子区室化增强酵母的盐耐受性[39]。Bassil等通过双突变体胁迫实验发现，内膜NHXs缺失将使种子萌发和幼苗生长对盐胁迫极为敏感，在100 mmol/L NaCl胁迫下，双突变种子在子叶出现后几乎停止生长，而150 mmol/L NaCl处理幼苗将导致鲜重显著下降[44]。安静等在拟南芥中过表达AtNHX5发现，过表达能提高种子萌发和苗期的耐盐性，过表达植株在盐胁迫的干重、鲜重及地上部分Na+、K+含量均高于野生型植株，耐盐性得到显著提高[53]。王立光等运用酵母表达系统研究发现，AtNHX5和AtNHX6除了能恢复酵母突变体的耐盐能力外，在维持K+平衡方面也具有重要作用，也能够恢复酵母突变体耐高钾胁迫的能力[15]。他们对AtNHX5和AtNHX6与AtCHX17在K+转活力的异同进行了比较，发现在高K+低pH下AtNHX5和AtNHX6起作用，而AtCHX17在低K+高pH下具有作用[15]，这表明了拟南芥内膜NHX与CHX的K+转运模式可能存在差异。他们进一步研究发现，在低K+条件下，的根长生长明显受到抑制，而在双突变植株内恢复AtNHX5或AtNHX6的表达能消除这一现象。通过K+含量测定发现，在正常生长条件下，植株内的K+含量明显低于野生型植株[15]。这些研究成果表明，拟南芥内膜NHXs与基因家族其他成员一样，也具有调节Na+、K+平衡的作用，且转运模式也可能是相似的。同时，有报道显示，番茄LeNHX2、水稻OsNHX5、杨树PeNHX6和桑树MaNHX6都具有调节Na+、K+平衡的作用[1,45,47,49,54-55]，这些预示着这类亚家族成员在植物中存在相似功能，这都将为其他植物中此类反向转运体的研究提供思路。

内膜系统的pH稳态对细胞的功能至关重要。Martinier等研究发现，胞内不同细胞器及蛋白运输的膜结构囊泡的pH存在差异，而在烟草细胞内转入拟南芥内膜NHXs将使液胞分选受体(Vacuolar sorting receptor，VSR)、反面高尔基体管网状结构和液胞前体等的pH升高，表明拟南芥内膜NHXs在维持内膜系统pH稳态具有重要作用。Reguera等运用基于荧光蛋白pHluorin的pH传感器(pHluorin-based pH sensors) 测定了高尔基体、反面高尔基体管网状结构、次级液胞前体和液胞分选受体的pH，发现双突变植株的这些部位的pH均低于野生型植株[17]。另外，王立光等通过pH敏感的荧光探针BCECF (2¢,7¢-bis (carboxyethy1)-5-(6)-carboxyfluorescein，2¢,7¢-二(羧乙基)-5(6)-羧基荧光黄) 和微电极法分别对双突变体的根部细胞液胞和叶片细胞液的pH进行了测定，结果显示与野生型相比，其pH都降低[15]。樊立刚等发现AtNHX5和AtNHX6调节内质网的pH，双突变植株细胞内内质网的pH明显降低[19]。这些结果都表明，拟南芥内膜NHXs具有调节细胞pH平衡的功能，而在其他植物内类似基因对pH平衡调节的研究还未见报道。

4 AtNHX5和AtNHX6调节蛋白运输和存贮

植物蛋白在核糖体中合成后，部分蛋白需经内质网、高尔基体、反面高尔基体管网状结构和多胞体/液胞前体，最终到达相应部位，在这个过程中，蛋白通过囊泡运输实现转运。现有的证据已经表明，在拟南芥中这些部位都存在内膜NHXs，它们调节囊泡运输，影响蛋白的转运和存贮。Bassil等最先发现AtNHX5和AtNHX6与囊泡运输相关，他们发现与野生型相比，FM4-64在双突变体中运到液胞的时间被延迟，用GFP标记的CPY蛋白在子叶中不能进入液胞，而是分布到了质外体，同时转录组分析也显示，内很多与囊泡运输相关的蛋白转录水平发生了改变，如RAB、VTI12、VPS35和VSR1等[44]。后来Reguera等进一步发现的种子变大，种皮变黑，种子中的PSV (Protein storage vacuoles) 体积变小而数目增多，存在大量种子贮藏蛋白的前体蛋白p2S和p12S，且种子贮藏蛋白2S和12S被运输到质外体，而非PSV中；他们深入研究认为拟南芥内膜NHXs缺失导致液胞分选受体2;1 (Vacuolar sorting receptors2;1, VSR2;1) 与其运输物 (Cargoes) 间的结合作用降低，从而影响了蛋白质的运输过程，且内膜NHXs对内膜体pH的影响在蛋白质运输调节方面起着重要作用[17]。Ashnest等也发现拟南芥内膜NHXs影响种子蛋白存贮，并证明拟南芥内膜NHXs的C-末端与细胞分选复合体Retromer的组分SNX1相互作用，影响液胞分选受体从反面高尔基体管网状结构回送到内质网的过程从而调节蛋白的运输[46]。武学霞等通过构建三突变体发现，三突变体植株矮小，结实率下降，种子体积增大，种子的PSV体积变小而数目增多，存在大量种子贮藏蛋白前体蛋白，这表明种子贮藏蛋白运输受到影响。他们发现在双突变体细胞内形成SNARE (Soluble N-ethylmaleimide- sensitive factor attachment protein receptor) 的成员SYP22和VAMP727聚集在高尔基体和反面高尔基体管网状结构中，未能被向下运送到液胞前体内，从而影响SNARE调控液胞前体和液胞之间生物膜融合的过程，导致蛋白运输受到影响[16]。

虽然以上研究对拟南芥内膜NHXs调节蛋白运输和存贮提出了不同的分子机制，但都明确了AtNHX5和AtNHX6参与调节蛋白运输过程。由已有的关于AtNHX5和AtNHX6的亚细胞定位报道，我们知道它们定位比较特殊，位于内质网、高尔基体、反面高尔基体管网状结构和多胞体/液胞前体，并且调节这些部位的pH平衡，而植物中很多蛋白在核糖体开始合成后，正好需要经过这些部位后，才能到达特定的位置，因此AtNHX5和AtNHX6会参与到蛋白运输的许多环节上。

5 拟南芥内膜NHXs具有影响其功能的保守氨基酸残基

Bowers等进行序列比对发现，在酵母、细菌、植物和动物的NHX的跨膜区域存在4个保守的酸性氨基酸残基，将酵母ScNhx1p中的4个氨基酸残基分别突变为不带电荷的极性氨基酸残基 (D201N、E225Q、D230N、E355Q)，其中3个突变氨基酸残基 (D201N、E225Q、D230N) 中任何一个突变都会导致酵母蛋白运输受阻，表明这3个保守氨基酸残基在蛋白转运过程中具有重要作用[56]。王立光等将AtNHX5和AtNHX6与ScNhx1p的氨基酸序列进行比对分析，发现在拟南芥内膜NHXs的跨膜结构域也含有4个保守的酸性氨基酸残基，AtNHX5的酸性氨基酸残基D164、E188、D193、E320和AtNHX6的D165、E189、D194、E320氨基酸残基，分别与酵母ScNhx1p的D201、E225、D230、E355保守氨基酸残基相对应[15]。通过酵母生长实验发现，如果AtNHX5的D164、E188、D193或AtNHX6的D165、E189、D194中任何一个保守氨基酸残基突变，都将导致拟南芥内膜NHXs在酵母内具有的互补功能丧失。同时，AtNHX5的D164、E188、D193或AtNHX6的D165、E189、D194中任何一个保守氨基酸残基突变也将不能使双突变植株生长恢复到野生型水平[15]。武学霞等进一步证实，拟南芥内膜NHXs的3个保守酸性氨基酸在种子存贮蛋白转入PSV过程中具有重要作用，任何一个酸性保守氨基酸残基突变都会使转基因株系种子中存贮蛋白像双突变的一样，含有大量前体蛋白p2S和p12S[16]。这些结果显示，3个保守酸性氨基酸残基对AtNHX5和AtNHX6的离子运输、蛋白转运及调节生长发育等功能至关重要，也暗示这3个保守氨基酸残基很可能影响AtNHX5和AtNHX6对pH平衡的调节。

6 拟南芥内膜NHXs在植物改良中的应用

Shi等从拟南芥Landsberg的实生苗叶片内克隆得到基因的cDNA序列，并导入蓝猪耳植株内，发现表达的蓝猪耳植株的耐盐力获得提高，转基因植株能在100 mmol/L NaCl的培养基上生长，而野生型不能生长[50]。他们进一步发现AtNHX5不仅提高了转基因蓝猪耳叶片富集Na+的能力，还对盐处理降低叶片K+含量有着显著的削弱作用，证实AtNHX5能应用于提高蓝猪耳的耐盐性，并认为其对植物耐盐性的改良作用与该反向转运体对Na+和K+的富集有关[50]。林小浩等通过AtNHX5转化烟草发现，转基因植株在300 mmol/L NaCl的条件下，生长明显优于野生型，且处理4 d后去除盐胁迫，转基因植株快速恢复生长，而野生型生长停滞，这表明AtNHX5能提高烟草耐盐性，可用于培育耐盐烟草品种[57]。Li等分别在水稻和构树中表达AtNHX5发现，转基因水稻和构树不仅增强了对盐胁迫的耐受力，还增强了抗干旱胁迫的能力，这暗示AtNHX5也可在抗逆境胁迫树木和作物改良中进行有效利用[58-59]。Wu等和杨权等都对基因转化大豆开展了研究，他们的结果都证明，AtNHX5转化大豆能增强大豆的耐盐性，可用于大豆抗盐品种的改良利用[60-61]。另外，有研究表明，在马铃薯内转入并表达AtNHX5或AtNHX6基因，可以提高转基因植株的耐盐性和抗旱性，提高块茎产量[62]。

7 展望

内膜NHXs亚家族作为NHXs家族重要成员之一，在植物的生长发育和逆境胁迫中起到重要的作用。近些年，植物中内膜NHXs的研究工作相继展开，尤其AtNHX5和AtNHX6的亚细胞定位、基因表达、功能和抗逆改良应用等取得了一系列进展，但关于它们过表达能否影响蛋白存贮的研究还未见详细报道，尚需深入研究。虽然越来越多物种的内膜基因被鉴定和克隆，但针对内膜NHXs的研究，大多仍围绕模式植物拟南芥的AtNHX5和AtNHX6展开，其他植物中类似反向转运体的亚细胞定位、功能等研究才初步开展。因此，其他植物的内膜NHXs的研究有待进一步深入。这将对培育抗逆作物新品种及提高作物产量具有重要的意义。

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Progress in endosomal Na+,K+/H+antiporter in

Liguang Wang

Biotechnology Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China

Important progress has been made in the interpretation of subcellular location, ion transport characteristics and biological functions of endosomal Na+,K+/H+antiporter in. The endosomal Na+,K+/H+antiporter contain two members, AtNHX5 and AtNHX6, whose amino acid sequence similarity is 78.7%. Studies have shown that AtNHX5 and AtNHX6 are functionally redundant, and they are all located in Golgi, trans-Golgi network (TGN), endoplasmic reticulum (ER) and prevacuolar compartment (PVC). AtNHX5 and AtNHX6 are critical for salt tolerance stress and the homeostasis of pH and K+. It has been reported that there are conservative acidic amino acid residues that can regulate their ion activity in the endosomal NHXs transmembrane domain, which plays a decisive role in their own functions. The results of the latest research indicate that endosomal NHXs affect vacuolar transport and protein storage, and participate in the growth of auxin-mediated development in.. In this paper, the progress of subcellular localization, ion transport, function and application of endosomal NHXs in.was summarized.

endosomal Na+,K+/H+antipoporter, subcellular localization, ion transport, vacuolar trafficking, protein storage

December 26, 2018;

March 14, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31660391, 31460350), Youth Foundation of Gansu Academy of Agricultural Sciences (No. 2016GAAS53), National Oil Industry System (No. GARS-17-SYZ-6).

Liguang Wang. Tel/Fax: +86-931-7612683; E-mail: wodepengyouwlg@163.com

国家自然科学基金 (Nos. 31660391, 31460350)，甘肃省农业科学院中青年基金 (No. 2016GAAS53)，国家特色油料产业技术体系(No. CARS-17-SYZ-6) 资助。

2019-03-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190327.1029.001.html

王立光. 拟南芥内膜Na+,K+/H+反向转运体研究进展.生物工程学报, 2019, 35(8): 1424–1432.Wang LG. Progress in endosomal Na+,K+/H+ antiporter in Arabidopsis thaliana. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1424–1432.

(本文责编 陈宏宇)