花椒油树脂加速贮藏期间麻味物质组成及麻感变化

方正，高海燕，赵镭，史波林，汪厚银，张璐璐，刘龙云，钟葵*

(1.上海大学 生命科学学院，上海 200444；2.中国标准化研究院食品与农业标准化研究所，北京 102200)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)系芸香科花椒属植物，其枝、干、叶均有食用和药用功效，其中花椒果皮是我国特色香辛料，被誉为“八大调味品之一”，以其独特的椒麻风味深受人们喜爱[1]。目前红花椒的主要产地为陕西韩城、山东泰安、四川汉源、茂汶和会阳、甘肃武都、河北涉县等[2]。

花椒油树脂是指采用适当溶剂从天然花椒中萃取、具有花椒全部风味特征的油状制品，既包含了挥发性花椒精油，又包含了不易挥发的麻味呈味成分。花椒油树脂通常被看作是应用和研究花椒风味成分的优质原料[3]，对现代餐饮和食品工业中方便而高效利用花椒中麻味有效成分具有重要意义[4]。目前，最常见的花椒油树脂萃取技术是超临界CO2技术，萃取过程无毒无害，克服了有机溶剂提取弊端的同时最大限度保留了花椒原有的风味成分[5]。

酰胺类物质是花椒中主要麻味呈味的来源，是评价花椒内在麻味品质的主要指标[6]。此外，麻感强弱、感官属性描述与酰胺类物质的种类及含量有一定相关性，不同产地花椒的麻味物质含量及麻感强度和特征均有较大的差异[7]。有研究表明花椒麻味特征非常不稳定，室温下贮藏1年后其香气和麻度有明显降低，麻味品质劣化较为显著[8]。目前，关于花椒及其制品中麻味物质成分和麻感贮藏期内变化的系统研究较少，研究手段和内容均较为单一，有待进一步完善。本文以花椒油树脂为研究对象，采用HPLC-MS在分析麻味物质总含量基础上，对麻味物质的组成及加速贮藏期间的动态变化进行跟踪观测。在此基础上，采用线性标度法和斯科维尔指数法分析贮藏前后麻度和麻感属性的变化，旨在为花椒及其制品贮藏期麻味物质及麻感变化研究提供基础参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3个不同产地花椒油树脂样品由韩城市宏达花椒香料有限公司提供，当季采收花椒样品后采用超临界CO2工艺加工制成。其中，PO-GW由甘肃武都产区红花椒制成，PO -SY由四川汉源产区红花椒制成，PO -SH由陕西韩城产区红花椒制成。

羟基-β-山椒素标准品：成都麦德生科技有限公司，纯度≥98.0%；无水乙醇：分析纯，河南荣腾食品添加剂有限公司；甲醇：色谱纯，Fisher实验器材(上海)有限公司；食用酒精：体积分数为95%，食品级；纯净水：符合GB 17323-1998对饮用纯净水的要求；色谱测试中应用水为超纯水。

1.2 主要仪器设备

PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司；恒温恒湿箱系统 巨孚仪器有限公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；TSQ Quantum液质联用仪 赛默飞世尔科技有限公司；ZORBAX 300 SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm) 安捷伦科技有限公司。

1.3 样品加速贮藏期设置

3种不同花椒油树脂样品混合均匀后进行分装，每瓶10 g样品，采用密封棕色玻璃瓶分装(基本填满容器)、加盖密封后，置于恒温(37 ℃)恒湿(20%)箱中避光贮藏，每隔30 d取出1瓶进行麻味物质及麻感测定，检测后样品弃用。样品贮藏期设置为4个月，每个时间点设置2个重复。

1.4 麻味物质测定

1.4.1 麻味物质样品制备

称取1 g花椒油树脂样品(精确到0.01 g)置于100 mL棕色具塞锥形瓶中，加入75 mL乙醇振荡摇匀，加盖密封于20 ℃恒温超声(频率40 kHz)提取20 min。将混合溶液全部转移至离心管中，2000 r/min转速下离心5 min，收集至100 mL棕色容量瓶中。沉淀用少量乙醇洗涤、涡旋1 min，在2000 r/min转速下离心5 min，将清液转移至容量瓶中。重复洗涤沉淀1次，将上清液移入容量瓶中，用乙醇定容，得到麻味物质提取母液。精确称取100 μL麻味物质提取液，用甲醇稀释定容于10 mL后用0.45 μm有机系微孔滤膜过滤，转移至液相进样小瓶中，即液相供试样溶液。每个样品3个平行样。

1.4.2 HPLC-MS分析条件

色谱条件：ZORBAX 300 SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相为甲醇-水溶液，洗脱梯度见表1，检测波长268 nm，柱温30 ℃，流速1.3 mL/min，测试时间56 min，进样量5 μL。每个样品测定3次。

表1 流动相洗脱梯度Table 1 Gradient elution of mobile phase

离子源：电喷雾电离源(ESI)；测定模式：全扫描模式，扫描质量范围：50～600 amu；喷雾电压：3300 V；气化温度：300 ℃；鞘气(氮气)压力：50 psi；辅助气(氩气)压力：20 bar；毛细管温度：325 ℃。

定性分析：参考文献[9]的方法，通过对样品总离子流图、提取离子流图及分子量在50～600 amu之间的离子二级碎片信息进行分析，确定其化合物分子量，计算化合物组成等，并结合文献进一步推断，对色谱峰进行定性。

定量分析：参考文献[10]的方法，精确称取羟基-β-山椒素标准品，用甲醇溶解后配制成不同浓度的标准溶液，进行HPLC检测。以色谱峰面积为纵坐标，标品浓度为横坐标，绘制标准曲线。本研究中，采用高、低浓度两条羟基-β-山椒素标准曲线来使定量结果更可靠。贮藏期间，每次样品测定前重新配制标品溶液和标曲绘制。

1.5 麻感感官评价

1.5.1 感官评价小组的建立

剔除对麻味食品有强烈嗜好性及排斥感的评价员，根据GB/T 16291.1-2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》进行评价员的筛选和培训，筛选出6～8名评价员组成感官评价小组，使其对麻感具有较高分辨力，达到能开展差异评价的评价员基本要求。

1.5.2 供试样品的制备

称取贮藏花椒油树脂1 g(精确到0.01 g)，用食用酒精溶解配制成10 mg/mL母液，再用纯净水稀释至0.30 mg/mL制成待试液，备用。

1.5.3 麻度的评价

1.5.3.1 线性标度法[11-13]

采用实验室前期建立的花椒麻度感官评价的15 cm标记线性标度[14,15]。首先，由经验丰富的感官分析师统一评价小组感觉测量范围，建立3点麻感标度及其标度值：3 cm-微麻、7.5 cm-麻、10 cm-很麻，并配制对应麻感标度值的麻感参比样液。开展感官评价员的麻感评价培训，直至其能熟练掌握标尺浓度所对应的麻感强度，即可开始对样品麻度进行评价。评价员正式评价前先漱口清洁口腔，供试溶液入口后含15 s，待其充分浸润口腔后吐出，闭口等待麻感强度达到最大值时于回答表中15 cm标度尺上进行标记。评价完一个样品后用纯净水漱口、吃苏打饼干并休息，直至口腔麻感完全消退后再进行下一次评价，每个评价员重复评价3次。

1.5.3.2 麻感属性强度

结合文献研究以及感官分析师和感官评价小组的多次试验与讨论[16-18]，筛选并确定出花椒的6个麻感分属性描述词：针刺感、振动感、灼热感、涩感、木感和垂涎感。训练考察评价员直至熟练掌握分属性感觉及其强度后开始正式评价。属性释义参考实验室前期研究，建立分属性强度值及对应描述，见表2。

表2 麻感属性强度值及描述Table 2 Attributes and description of pungency sensation

1.5.3.3 斯科维尔指数法[19，20]

采用斯科维尔指数(SPU)法，将麻味物质提取母液按照一定比例逐级稀释，被评价员恰好识别出有麻感时的最低浓度样品稀释液，再根据稀释倍数再转化为SPU值得到麻度的不同等级。每个评价员重复评价3次。

1.6 数据分析

数据采用 Excel 2010 和 Origin 2017 进行分析。

2 结果与讨论

2.1 花椒油树脂样品中麻味物质含量分析

采用HPLC-MS对3个不同产地的花椒油树脂各色谱峰进行定性定量分析。花椒油树脂样品HPLC见图1，定性方法参考实验室前期研究基础，通过样品总离子流图、离子二级碎片信息(分子量在500～600之间)进行分析，根据最大吸收峰和质荷比，结合文献[21,22]确定主要麻味物质种类。进一步分析所得麻味物质的峰面积，采用标准曲线换算出各物质的羟基-β-山椒素当量，对各麻味物质相对含量进行定量分析，结果见表3。

图1 不同产地花椒油树脂样品的HPLC图Fig.1 The UPLC chromatograms of pepper oleoresin samples in different producing areas

表3 不同产地花椒油树脂样品中麻味物质组成及含量Table 3 Composition and content of pungent components of pepper oleoresin samples in different producing areas mg/g

由图1和表3可知，花椒油树脂中麻味物质属于酰胺类物质，3个不同产地的花椒油树脂具有相似的HPLC图谱，麻味物质种类组成差异较小。定性结果表明，3个样品共确定出11种麻味酰胺类物质，其中共有物质为9种，分别为：羟基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)、羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素、γ-山椒素和四氢花椒素。此外，PO -GW还含有二氢花椒素和异二氢花椒素2种物质，而PO -SH样品不含有二氢花椒素，PO -SY样品中未检出异二氢花椒素。

样品定量结果表明，3个花椒油树脂样品麻味物质含量上有显著差异。来自于四川汉源的PO-SY样品中总麻味物质含量最高，为501.5 mg/g；其次是甘肃武都的PO-GW样品，为465.0 mg/g；含量最低的是陕西韩城的PO-SH样品，为389.0 mg/g。11种麻味酰胺类物质中，羟基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)是含量最高的重要麻味物质，4种物质之和分别占3个样品中总麻味物质含量的97.07%、95.06%和98.34%。但不同样品中4种羟基-山椒素组成含量存在差异。PO-SY样品呈现低羟基-α-山椒素(68.41%)、高羟基-γ-山椒素(18.49%)和低羟基-ε-山椒素(1.52%)的特点。PO-GW和PO-SH样品均呈现高羟基-α-山椒素(高于76%)的特点，同时PO-SH样品表现出高羟基-β-山椒素(15.57%)、高羟基-ε-山椒素(4.86%)和低羟基-γ-山椒素(1.69%)的特点。有研究通过对多个产地的花椒样品麻味物质构成特征进行分析[23]，通过计算比较相对峰面积的相对标准偏差(RSD)，得到不同产地红花椒之间化学成分含量有一定差异的结论。余晓琴等[24]在研究中发现，羟基-γ-山椒素的含量可作为区分红花椒与青花椒的特征物质。此外，在含量较低的其他麻味物质组分中，3个花椒油树脂样品中含量差异较大，PO-SY样品中花椒素和γ-山椒素含量显著高于其余2个样品，与文献[20]中四川汉源花椒中特征麻味物质结果一致。

2.2 加速贮藏期间花椒油树脂样品麻味物质含量测定

酰胺类麻味物质本身不稳定，容易发生一系列异构化、水解以及氧化反应，贮藏期间会发生麻味物质含量降低的现象，从而影响最终产品的品质[25]。因此，麻味物质含量，包括不同麻味物质组分含量的变化是反映花椒及其制品贮藏性及衡量贮藏效果的重要指标[26]。研究表明影响麻味物质含量稳定性的因素很多，时间和温度是最主要因素，其次还包括光照、氧气等相关因素。通常，市售的花椒油树脂产品通常是避光、密封保存，存放温度为常温或冷藏，一定程度上能减缓麻味物质损失。为了更好观察温度和时间对麻味物质的影响，本研究采用加速实验(37 ℃)来观察3种花椒油树脂样品的麻味物质含量随时间的变化，见图2。

图2 37 ℃加速贮藏期间3个花椒油树脂样品中麻味物质含量变化Fig.2 The changes in the content of pungent components in three pepper oleoresin samples during accelerated storage at 37 ℃

120 d加速贮藏期间，3个样品中麻味物质总含量发生了不同程度降低。PO-SY样品贮藏30 d时总麻味物质含量没有显著变化(p>0.05)，但60 d时总含量显著降低(p<0.05)，之后随贮藏时间延长进一步下降，贮藏120 d时下降了约15%；其次是PO-SH样品，90 d贮藏期间含量虽有轻微降低但并未达到显著水平(p>0.05)，但120 d时总麻味物质含量显著降低(约10%)。PO-GW样品在120 d贮藏期间总麻味物质含量虽轻微降低但未达到显著水平(p>0.05)。

由图3可知，3个样品的4种主要麻味物质含量在贮藏过程中，总麻味物质含量降低表明贮藏过程中花椒油树脂中的麻味物质有损失，但不同麻味物质组分在整个贮藏期间呈现不同的变化趋势。对4种主要的麻味物质——羟基-山椒素物质(α-、β-、γ-和ε-)在贮藏期间含量的动态变化进行了分析。羟基-α-山椒素是含量最高(高于总麻味物质含量的2/3)的麻味物质组分，贮藏120 d期间，PO-GW样品中羟基-α-山椒素含量没有显著变化(95.04%)，而PO-SY和PO-SH样品分别降低了约12%和16%(p<0.05)。PO-SY样品的羟基-β-山椒素含量在贮藏期间没有显著变化(p>0.05)，但PO-GW和PO-SH样品中的含量分别显著增加了约13%和8%(p<0.05)。羟基-ε-山椒素在总麻味物质中比例较小，120 d贮藏期间，整体含量变化不显著(p>0.05)。羟基-γ-山椒素是PO-SY样品中含量最高的，也是PO-SY样品中典型的麻味物质之一，120 d贮藏期间其含量显著降低，在3个样品中分别降为原含量的80.01%、68.61%和67.93%(p<0.05)。

图3 4种主要麻味物质含量变化趋势Fig.3 Change trend in the content of four main pungent components

研究表明羟基-山椒素(α-、β-和ε-)三者的相对分子量均为263，互为同分异构体[27]，在某些调节下可能会相互转化。因此，推测贮藏期间3个样品总麻味物质含量降低和单一麻味组分或增或减的变化与3种同分异构体之间可能发生的转化有关。麻味物质的损失和麻味感官贡献不同的单体之间的相互转化，最终造成贮藏期内花椒油树脂的麻味感官品质的变化。

2.3 花椒油树脂样品中麻感的感官分析

图4 花椒油树脂样品贮藏期间麻感最大强度测定Fig.4 Detection of the maximum pungent intensity of pepper oleoresin samples during storage

表4 花椒油树脂样品贮藏期间麻感强度测定(SPU)Table 4 Detection of pungent intensity of pepper oleoresin samples during storage(SPU)

应用线性标度法和斯科维尔指数法对3个花椒油树脂样品的初始样的最大麻感强度值及SPU值进行了分析，见图4和表4。PO-GW和PO-SY样品的最大麻感强度值较为接近，而PO-SH样品则比较低，分别为PO-SY(10.4±0.46)、PO-GW(9.53±0.51)、PO-SH(7.87±0.48)，与麻味物质含量成一定正相关，SPU值也呈现类似结果。图5a列出了花椒油样品的6种麻感属性强度值，可知PO-SY样品振动感、垂涎感较为突出，PO-GW样品涩感最明显，PO-SH样品除木感较强外，其余属性均中等。结合麻味物质含量的高低及组成差异，表明不同产地来源样品的麻感感官属性也呈现出差异。

2.4 加速贮藏期间花椒油树脂样品麻感的感官分析

贮藏120 d期间3个花椒油树脂样品最大麻感强度的变化见图4。由图4可知，随贮藏时间延长，样品最大麻感强度均呈现下降趋势，90 d呈现显著性变化，贮藏120 d后最大麻感强度分别为PO-SY(8.88±0.18)、PO-GW(8.25±0.35)和PO-SH(7.33±0.14)。SPU值结果见表4，120 d后均显著下降，与线性标度法结果变化趋势一致。由图5b可知，6种麻感属性中，垂涎感、振动感和灼热感减弱程度较大。有研究表明[28]，不同的麻味酰胺类物质单体具有不同的特征麻感属性体现，含量高低与贮藏期间的含量变化导致了麻感感官属性的差异与变化。

图5 花椒油树脂样品贮藏期间麻感分属性强度测定Fig.5 Detection of pungent subattribute intensity of pepper oleoresin samples during storage

注：a为贮藏0 d；b为贮藏120 d。

3 结论

本研究采用HPLC-MS、感官分析等技术，对3个不同产地花椒油树脂样品在加速贮藏期间麻味物质组成、含量和麻感的感官分析进行了测定，具体结果如下：

不同产地花椒油树脂中麻味物质共有成分有9种，包括4种羟基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)和5种酰胺类物质(羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素、γ-山椒素、四氢花椒素)，其中4种羟基-山椒素含量占总麻味物质含量的95%以上。3个不同来源花椒油树脂样品总麻味物质含量及4种羟基-山椒素组成具有显著差异(p<0.05)，其中，PO-SY麻味物质含量最高。

120 d贮藏期间，PO-GW总麻味物质含量没有显著变化，但PO-SY和PO-SH样品中总麻味物质含量显著下降(p<0.05)，其中PO-SY下降最多。3个样品中麻味物质变化趋势呈现共性，表明存在一定规律。不同羟基-山椒素成分呈现不同的变化趋势，整体上羟基-山椒素(α-、γ-)含量呈下降趋势，羟基-β-山椒素含量呈上升趋势，羟基-ε-山椒素含量没有显著变化，表明贮藏期间麻味物质成分存在相互转化。

3个花椒油树脂样品的最大麻感强度和SPU值均存在显著差异，其中PO-SY样品的最大麻感强度值最高。PO-SY样品振动感、垂涎感较为突出，PO-SH样品木感较强，而PO-GW样品涩感较为明显。120 d贮藏期间，样品的最大麻感强度和SPU值均有不同程度降低，麻感的感官属性中垂涎感、振动感和灼热感减弱程度较大。推测样品的麻感强度及感官属性不仅与麻味物质总含量相关，同时与麻感贡献不同的单一组分麻味物质含量也具有一定的相关性。后期将进一步开展麻味物质组成及含量与麻感强度及感官属性强度的相关分析。相关研究结果可为花椒及其制品的品质控制提供科学依据。