双参通脉颗粒对大鼠心肌缺血NF-κBp65蛋白表达的影响

心肌短时间缺血致其无法得到充足的营养，再通后会造成心肌一定程度损伤，称为急性心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI常伴炎症反应，血中炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等大量释放，介导心肌氧化损伤，使损伤恶化加重。NF-κBp65是细胞核内重要的转录调节因子，在炎症因子的刺激下，NF-κBp65通常依赖经典信号途径被活化，介导细胞凋亡。本实验采用左冠状动脉结扎法复制大鼠心肌缺血模型，观察双参通脉颗粒对心功能的保护作用，探讨其对炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及心肌组织NF-κBp65蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 双参通脉颗粒(ginseng and salvia granules for promoting blood flow，GSG)为辽宁中医药大学附属医院院内制剂，合心爽(盐酸地尔硫卓片，diltiazem hydrochloride，DH)购自天津田边制药有限公司，IL-1β检测试剂盒、IL-6检测试剂盒、TNF-α检测试剂盒购自凯基生物有限公司，NF-κBp65抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 实验仪器 5234R型高速离心机(德国Eppdendorf公司)，BB23型培养箱(美国PE公司)，ROTEAN电泳系统(美国Bio公司)，冰冻切片机OM3123型(瑞典Bio公司)，恒温恒湿箱(上海科技生物公司)，Leica图像分析仪(德国Leica公司)。

1.3 心肌缺血模型的复制 SD大鼠40只，2.5%戊巴比妥腹腔内注射麻醉，成功后，取大鼠仰卧位固定于手术台上，气管切开插管，小动物呼吸机辅助呼吸，调节参数：频率85次/min、潮气量18 mL、呼吸比1∶1，于术中记录Ⅱ导联心电图。颈部、心前区剪毛，碘伏消毒术野，心前区胸骨左侧第3肋间切口，逐层钝性分离皮下组织，沿肋间剪开肌肉，分离肋骨，暴露心包，大鼠呼气末破入胸膜，进入心包，小心剪开心包膜，暴露心脏，左右各上一眼科用小拉钩使心脏暴露充分，找到左心耳，于肺动脉圆锥与左心耳交界处下方确定结扎位置，以6-0号带线缝合针在冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下方2 mm处结扎，进针深度约2 mm，心电图(ECG)监测到ST段抬高0.2 mV即为造模成功，持续30 min后打开结扎线，再灌注120 min，胸腔放置引流管，逐层缝合肋骨、肌肉，关闭胸腔，抽出胸腔积气积液，拔出引流管。

1.4 实验动物分组与给药 健康成年SD大鼠，体重280～300 g，随机分为4组，每组10只。假手术组(sham operation group，Sham组)只开胸不结扎，生理盐水灌胃，1次/日，连续4周；模型组(MIRI组)开胸结扎LAD 30 min，再灌注120 min，生理盐水灌胃，1次/日，连续4周；合心爽治疗组(DH组)：开胸结扎LAD 30 min，再灌注120 min，合心爽灌胃，4.23 mg/kg，1次/日，连续4周；双参通脉颗粒治疗组(GSG组)开胸结扎LAD 30 min，再灌注120 min，双参通脉颗粒灌胃，按大鼠体表面积给药，相当于生药量11 g/kg，1次/日，连续4周。

1.5 血流动力学测定 取材前，分离右侧颈总动脉，左心导管插管至左心室，由 ALC-MPA 多导生物信号分析系统记录血流动力学参数，包括左室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVDP)、心率(HR)。

1.6 取材方法 经腹主动脉负压采血2～10 mL，低温离心，试管编号后，留存备用；取左室中部连续2块厚2～3 mm 心肌组织，浸泡于4%多聚甲醛中，病理学观察；剩余缺血区心肌组织置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.7 实验前后大鼠心率变化测定 将大鼠麻醉后仰卧固定于实验台上，按照右上肢红色，右下肢黑色，左上肢黄色，左下肢绿色的顺序，将肢导联的电极针插入动物四肢的皮下(注意不要插入四肢肌肉)，连接好导联线至心电图机，即可进行心电图的记录。全程记录各组大鼠一般状态及心率变化，并判定造模是否成功。

1.8 心肌组织病理变化观察 组织标本固定于4%多聚甲醛中，观察时各级乙醇脱水，石蜡固定，进行常规切片，再于二甲苯、各级乙醇中脱水，苏木精-伊红(HE)染色，二甲苯透明、中性树胶封片，光镜下观察左心室组织学改变。

1.9 血清IL-1β、IL-6、TNF-α测定 经腹主动脉负压采血 2～10 mL，3 000 r/min离心取血清，酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按试剂盒说明书进行。

1.10 心肌组织NF-κBp65蛋白表达 提取总蛋白，加液氮研磨，加RIPA裂解液，漩涡混匀，放置 1 h ，4 ℃，13 000 r/min离心 20 min，检测蛋白浓度，计算所需蛋白上样量，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，电压100 V，恒压转膜90 min，转移到硝酸纤维膜上。转膜完成后，牛奶封闭1 h，PBST溶液洗膜3次，每次7 min，加入一抗，孵育4 h，PBST 洗膜 3次，每次7 min。加入溶有鼠或兔二抗的牛奶，室温孵育 1 h，PBST 洗膜3次，每次10 min，加显色液显色，暗室中显影。ImageJ软件进行western蛋白定量分析。

2 结 果

2.1 血流动力学(见表1)

组别只数LVSP(mmHg)LVDP(mmHg)HR(次/min)Sham组10124.84±6.14 6.34±1.4821.63±5.32 MIRI组1096.32±6.191)14.16±2.041)40.07±7.981)DH组 10110.36±4.012)10.78±1.372)19.08±4.312)GSG组10130.57±1.082)3)7.16±1.972)3)13.25±3.642)3)F值5.6482.3493.241P<0.01<0.01<0.01

注：1 mmHg=0.133 kPa。与Sham组比较，1)P<0.05；与MIRI组比较，2)P<0.05；与DH组比较，3)P<0.05

2.2 造模前后大鼠心电图变化(见图1)

A为术前；B为术后

2.3 各组大鼠心肌病理变化 Sham组：心肌细胞排列紧密、规整、间隙小，未发现有明显水肿区域存在，肌纤维无明显扭曲。心肌细胞膜完整、界限清晰、细胞核位置居中，细胞间隙无红细胞出现，炎症浸润。MIRI组：肌纤维扭曲紊乱，亦有部分纤维断裂；细胞肿胀变大，组织间隙增宽，水肿现象明显，炎细胞浸润布满视野；细胞间隙可见大量红细胞存在，出血情况严重；细胞核散乱无规律。DH组：炎细胞浸润明显，红细胞渗出较多，然而细胞间的水肿情况有所好转，肌纤维断裂现象较少。GSG组：与MIRI组比较损伤显著降低，显微镜下观察时细胞边界清晰、轮廓完整，组织间隙仍有不同程度水肿，但整体较轻，红细胞渗出不多。详见图2。

图2 心肌组织病理改变(HE染色，×200)

2.4 血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量变化(见表2)

组别只数IL-1βIL-6TNF-α(×103)Sham组10184.35±4.64124.03±6.101.53±0.25MIRI组10286.52±6.191)164.37±1.361)1.94±0.361)DH组 10195.21±3.122)139.15±4.132)1.26±0.122)GSG组10164.27±1.052)3)104.13±4.652)3)1.01±0.142)3)F值6.3142.2472.014P<0.01<0.01<0.01

与Sham组比较，1)P<0.05；与MIRI组比较，2)P<0.05；与DH组比较，3)P<0.05

2.5 心肌组织NF-κBp65蛋白表达 与Sham组(0.92±0.06)比较，MIRI组(1.63±0.07)NF-κBp65蛋白表达明显增加(P<0.05)；与MIRI组比较，DH组(1.53±0.13)NF-κBp65蛋白表达明显下降(P<0.05)；与DH组比较，GSG组(1.13±0.37)NF-κBp65蛋白表达明显下降(P<0.05)。详见图3。

图3 心肌组织NF-κBp65蛋白表达变化

3 讨 论

在心肌缺血再灌注损伤病理过程中，炎性介质介导的炎症反应起到了至关重要的作用，中性粒细胞释放炎症物质，诱导细胞黏附分子表达，促使粒细胞进入缺血区，加重氧化损伤[1-2]。心肌缺血氧化损伤可促进氧自由基的产生,刺激组织释放炎性介质，如IL-1β、IL-6、TNF-α等[3]，引发NF-κB信号转导通路的激活，放大炎症信号，组织中NF-κBp65蛋白表达增加。MIRI是系统炎症与局部炎症共同作用的结果[4-7]。NF-κB是一种具有调控细胞因子、化学因子功能的核转录因子，其对炎症反应、免疫应答及细胞凋亡均有调节作用，是参与MIRI细胞氧化损伤的主要作用靶点[8]。NF-κB的异常激活与心肌细胞凋亡密切相关。

GSG由中药人参、丹参、黄芪、麦冬、川芎、当归6味药组成，具有益气养阴、活血通络的功效。人参，五加科植物人参的干燥根，味甘苦、性平，归肺、脾、心经，具有大补元气、补脾益肺、生津安神等功效。现代药理研究证实人参皂苷对大鼠腹主动脉缩窄所致的心肌肥厚有抑制作用，其机制可能与干预NF-κB信号转导通路有关[9]。丹参，唇形科植物鼠尾草丹参的干燥根及根茎，具有活血调经、凉血消痈等功效。现代药理研究表明丹参具有抗血小板聚集、降低血液黏度、调节凝血系统的功能，是一种安全可靠的治疗心血管疾病的天然中药[10]。黄芪，豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的根，味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌的功效。黄芪皂苷可通过抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶增强心肌收缩力，改善心室构型和射血功能，改善心肌营养，降低心肌耗氧量，并可稳定细胞膜，从而减轻心肌细胞损伤[11]。麦冬，百合科植物麦冬的干燥块根，味甘、微苦，微寒，归心、肺、胃经，具有养阴生津、润肺清心的功效。麦冬总皂苷对心肌细胞缺氧再灌注损伤具有保护作用[12]。川芎，伞形科藁本属川芎的根茎，性温味辛，归肝胆经，为血中气药，行气活血，开郁止痛。川芎嗪可以通过抑制NF-κB信号通路，来改善由血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的新生小鼠心肌细胞肥大[13]。当归，伞形科植物当归的根，性温味甘辛，归心肝脾经，具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠的功效。当归提取液高剂量(80 mg/kg)条件下对血栓的形成有拮抗作用，阿魏酸及多种氨基酸具有抗心律失常、扩张血管、减少细胞凋亡等多种药理作用[14]。

本实验证实GSG组IL-1β、IL-6、TNF-α浓度明显减少，表明GSG能有效降低心肌IL-1β、IL-6、TNF-α浓度，减轻炎症反应，减轻心肌缺血再灌注损伤。GSG组心肌组织NF-κBp65蛋白表达明显降低，表明GSG可能通过调节NF-κB抑制心肌细胞凋亡。细胞凋亡是MIRI的重要损伤因素，本实验表明GSG能减轻心肌炎症反应，降低心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤，其机制可能与降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性介质，抑制NF-κBp65蛋白表达有关。