黑木耳的酶法液化加工条件研究

魏文毅　苗家尉　牛广财　王鹤霖　贾 建　魏春红

摘要：为提高黑木耳的深加工水平，采用单因素和正交试验，研究果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶对黑木耳液化效果的影响，优化复合酶法液化条件。结果表明：多酶复合处理液化黑木耳浆料，能明显提高其还原糖含量。适宜酶解条件为：固液比1∶6，三酶复合（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8），总用酶量3.2%（m/m），加酶方式为同时添加，作用温度55 ℃，适宜pH 5.5，时间4 h，处理样中的还原糖含量可达1.96%。

关键词：黑木耳;酶法水解;試验;黏度;还原糖含量

中图分类号：S646.4;TS201.1    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2019）04-0038-05

黑木耳（Auricularia auricula）是一种自然生长或人工栽培的药食两用真菌，具有较高的营养和保健价值。众多研究表明，黑木耳多糖为黑木耳的重要功能活性成分，衍生出以此为目标产物的多种制备方法，主要有热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法、超声波法等，这些方法都需要将黑木耳液态化，以获得黑木耳多糖产品。其中，酶法具有条件温和、工艺简便、省时，产品提取率高、品质优等优点，相关的研究报道较多，所涉及的酶有果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等，但绝大多数采用的是单一酶处理，用复合酶处理的较少，对液态化黑木耳（黑木耳提取液）的特性研究更少。以开发液态化及相关黑木耳制品为最终目的，深入研究复合酶法液化黑木耳的工艺条件，探讨液态化黑木耳体系的黏度变化，为提高黑木耳的深加工水平提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳（干品）：大庆市九区果蔬批发市场;纤维素酶（ 3万U/ g）和果胶酶（ 2万U/ g）：北京奥博星生物技术有限责任公司;木瓜蛋白酶（ 120万U/ g）：河北天旭实业有限责任公司.

氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、3，5-二硝基水杨酸（DNS），葡萄糖，三羟甲基胺基甲烷（Tris），浓盐酸等均为分析纯，来自天津金汇太亚化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

AR223CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司;L420台式低速自动平衡离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司;NDJ-79型旋转粘度计：上海精密仪器仪表有限公司;UV-1100紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司;SevenMulti pH计：梅特勒-托利多国际股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

1） 工艺流程。黑木耳→浸泡→清选→加水打浆→胶体磨细化→酶解→灭酶→冷却→过滤→滤液→检测

2） 操作要点。将称重黑木耳用适量清水泡发（室温，12 h）后清选除杂;按一定的固液比加水，用高速组织捣碎机打浆，再过一遍胶体磨;称取一定量的黑木耳浆料浆在恒温水浴锅中预热（10 min），添加适量活酶，在一定条件下水解;对酶解样液酶灭活（100 ℃，5 min），冷却;将灭酶样液用洁净尼龙滤布（80目）过滤，对滤液进行黏度和还原糖含量测定。

1.3.2 酶解条件的单因素试验

1） 固液比。加水打浆时，设置固液比分别为1︰3、1︰4、1︰5和1︰6（质量比），取100 g浆料进行酶解，分别选取3种酶（果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶）单独处理，其他条件固定（酶量1.2%、时间2 h、温度50 ℃、自然pH），设不加酶处理组为对照。

2） 单酶处理。分别用上述3种酶进行酶解，加酶量设置0，0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%和2.8%共8个水平，酶解2 h，固液比1∶6，其他条件为3种酶各自的最适合条件。

3） 双酶复合处理。将上述3酶两两组合，分别设置8∶2、6∶4、5∶5、4∶6和2∶8共6个水平。固液比1∶6，总用酶量均为2.4%，其他条件相同（温度50 ℃、自然pH，时间2 h）。

4） 三酶复合处理。选取上述3种酶同时作用，设置4∶1∶5、3∶1∶6、2∶1∶7、1∶1∶8、1∶2∶7、1∶3∶6和1∶4∶5共7个水平。同时，酶总用量分别设置1.2%、1.6%和2.0%共3个水平。其他条件同3。

1.3.3 复合酶处理条件优化 在上述试验结果的基础上，采用正交试验L9（34）设置4个因素（加酶量、提取pH、提取温度、时间）3水平试验，对三酶复合水解条件进行优化。复合酶（果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶8）同时添加，以还原糖含量为考察指标，每水平重复3次。

1.3.4 测定指标与方法 采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖含量;黏度测定采用NDJ-79型旋转粘度计。

2 结果与分析

2.1 料液比对黑木耳浆料黏度和还原糖含量的影响

料液比对黑木耳浆料黏度和还原糖含量的影响分别见图1和图2。

如图1所示，单酶处理时，酶解液的黏度变化在不同料液比间具有差异，其中1∶3和1∶4与1∶5和1∶6之间差异显著（p<0.05），但1∶5显著高于1∶6。

由图2所示，单酶处理时，酶解液中的还原糖含量均先升高后降低，但最高值所对应的料液比有所不同（果胶酶、纤维素酶为1∶4，木瓜蛋白酶为1∶5），且变化幅度不同。

试验结果显示：黑木耳浆料酶解液的黏度和还原糖含量均随着料液比的增大而明显降低;料液比对3种酶发生水解反应的影响具有一致性：当料液比偏小时，黏度较高，酶促反应在一定程度上受抑制，但因底物浓度较高，因此还原糖含量整体较高;随料液比增加，反应效率亦增强，还原糖含量进一步增加;随料液比继续增加，虽反应效率较高，但稀释效应导致还原糖含量降低。

与对照组相比，加酶处理组降低浆料体系黏度，提高还原糖含量，两者的变化量均随料液比的增大而增加（图3和图4）。进一步分析表明，对物料体系黏度的影响，纤维素酶和木瓜蛋白酶大强于果胶酶，对还原糖含量的影响则相反。

2.2 单酶和复合酶对黑木耳浆料黏度的影响

单酶处理时，酶解液黏度随加酶量的增多均呈下降趋势（图5）。其中，纤维素酶处理组显著低于果胶酶处理组（p<0.01）;但当加酶量>1.2%时，纤维素酶处理组与木瓜蛋白酶之間差异极显著（p<0.01）;当加酶量>0.4%时，果胶酶处理组与木瓜蛋白酶之间存在显著差异（p<0.05）。

上述结果表明：所用单酶处理均可降低黑木耳浆料体系的黏度，其中木瓜蛋白酶处理组的黏度下降最快，变化幅度最大。因此，可初步推测黑木耳浆料的高黏度特性受所含有的多糖、蛋白质及糖蛋白复合物等大分子物质影响，尤其是蛋白组分的影响最大。

双酶处理时，各处理组样液的黏度变化不同（图6）。在果胶酶同纤维素酶的组合中，不同比例间差异不明显，但样液黏度随纤维素酶比例增加呈降低趋势，说明纤维素酶对体系黏度降低的影响较果胶酶大，这与上述结果一致;在果胶酶与木瓜蛋白酶的组合中，黏度最低值出现在6∶4，就整体而言，木瓜蛋白酶在组合中比例的增加使黏度呈升高，纤维素酶与木瓜蛋白酶组合中也出现此现象，这与前述结果不一致（图3和图5），需进一步研究其原因。

果胶酶与木瓜蛋白酶组合处理样的黏度整体均显著高于其它两个组合的（p<0.01）。同时，三酶两两组后，双酶处理样的黏度均显著高于对应单酶处理样（p<0.01）。

三酶组合处理时，各处理对黏度的影响不同（图7）。在三酶配比固定时，酶用量增加，样液黏度降低明显，其中酶用量为1.2%时，其与1.6%和2.0%之间分别具有显著差异（p<0.05）和极显著差异（p<0.01），但在3个酶用量水平中，1∶4∶5（果胶酶︰纤维素酶︰木瓜蛋白酶）的黏度最低，说明在复合酶体系中，较高比例的纤维素酶和木瓜蛋白酶对体系的黏度降低作用较大，这与两者在单酶处理时的效应一致（图5）。然而，复合酶（双酶和三酶）与不加酶和加单酶处理样相比，样液黏度降低程度很小，有的甚至还略升高。其原因分析可能有：一是所用酶本身为蛋白质，酶促反应后未能从反应体系中去除，尤其是100 ℃，5 min灭酶操作可能使酶蛋白分子间反应形成大分子复合物，从而引起黏度略升高，抵消酶水解对体系黏度降低效应;二是复合酶处理较单一酶更能使黑木耳破壁，更有利于组织中可溶性多糖等可溶性组分溶出，使样液处于较高黏度，甚至升高。

2.3 单酶和复合酶对黑木耳浆料还原糖含量的影响

单酶处理时，由图8可知，随酶用量的增加，各处理中还原糖含量变化不同，但均呈增加趋势（图8）。其中，单酶用量大于0.8%时，果胶酶和纤维素酶对还原糖含量的增加变化与木瓜蛋白酶之间的差异极显著（p<0.01），其它处理间差异不显著（p>0.05）。

双酶处理时，各处理组样的还原糖含量变化不同（图9）。果胶酶与纤维素酶组合中，果胶酶对体系还原糖含量增加的贡献较纤维素酶大，这与前述结果一致（图4和图8）;在木瓜蛋白酶组合中，较高比例的木瓜蛋白酶对还原糖含量增加的贡献较大（图9），这一点与上述结果相反（图4和图8）。

果胶酶与纤维素酶组合处理的还原糖含量均显著低于其它2种组合（p<0.01），且该2种组合间差异不显著（p>0.05）。另外，双酶组合处理（除果胶酶︰纤维素酶=2∶8外）还原糖含量均明显高于对应单酶处理（p<0.01）。

就对还原糖含量的影响而言，双酶处理明显高于单酶处理，其效应不是各单酶的简单叠加，而是协同效应。

不同的三酶组合比例和总酶量差异，对样品还原糖含量影响程度不同（图10）。固定三酶配比时，随酶用量增加，样品中还原糖含量增加明显。其中，1.2%加酶量与1.6%和2.0%之间的差异极显著（p<0.01），但1.6%与2.0%间的差异不显著（p>0.05）。在酶用量渐增的三水平中，最高还原糖含量值分别为0.414%、0.578%和0.679%，其对应的三酶配比（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶）分别为1∶2∶7，1∶1∶8，1∶1∶8，说明木瓜蛋白酶占比例较高的复合酶处理体系中，样品还原糖含量变化较大。

在单酶处理、双酶处理和三酶复合中，三酶组合既能使酶用量降低，又能使黑木耳浆料中的还原糖含量升高。因此，选择果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶组合比例为1∶1∶8。

2.4 复合酶对黑木耳浆料水解条件的优化

同时添加三酶（果胶酶︰纤维素酶︰木瓜蛋白酶=1∶1∶8），设置四因素（温度、酶量、pH、时间）和每因素三水平对黑木耳浆料进行酶解优化处理，测定处理样中还原糖含量及分析如表1所示。

对还原糖含量影响由大到小的因素分别为加酶量、酶解时间，作用温度。复合酶水解处理条件的最佳优化组合为A1B3C2D2，即作用温度45 ℃，酶用量3.2%，pH为5.5，作用时间4 h。综合分析试验结果，确立复合酶液化黑木耳的适宜参数为：固液比1∶6，复合酶（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8）酶总用量3.2%（m/m），温度55 ℃，pH为5.5，作用时间为4 h。在该条件下进行验证试验，样品中还原糖含量的平均值为1.963%，液化黑木耳中的还原糖含量经复合酶处理后可明显提高。

3 结论

对黑木耳浆料黏度和还原糖含量变化的影响而言，前者单一酶大于复合酶，后者则相反。单独使用木瓜蛋白酶，对黑木耳浆料中还原糖含量变化的影响较弱，但在复合酶处理中，它在果胶酶和纤维素酶对还原糖含量增加作用中体现出协同性。多酶复合处理液化黑木耳浆料能明显提高其还原糖含量，对其适宜酶解条件为：料液比1∶6，三酶复合（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8），总用酶量3.2%（m/m），加酶方式为同时添加，作用温度55 ℃，适宜pH 5.5，时间4 h。

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Abstract： In order to improve the processing level of black fungus， the effects of pectinase， cellulase and papain on liquefaction of the black fungus were studied by single factor and orthogonal test， and the compound enzymatic liquefaction conditions were optimized. The results showed that： The content of reducing sugar in the black fungus slurry can be improved multi-enzyme compound treatment. The suitable enzymolysis condition of the black fungus were as follows： The solid-liquid ratio 1∶6， compounded by three enzymes （pectinase， cellulase， papain = 1∶1∶8）， the total amount of enzyme 3.2% （m/m）， and the enzyme was added at the same time. The enzymatic hydrolysis conditions was at pH 5.5， temperature 55 ℃ for 4 h. Under these conditions， the reducing sugar content reached up to 1.96%.

Key words： black fungus; enzymatic hydrolysis; experiment; viscosity; reducing sugar content