姬松茸多糖的提取及其对D半乳糖诱导衰老小鼠的免疫调节作用

李雨鑫,盛 瑜,杜培革,安丽萍,杨莹莹,郭长春,王佳琪

(北华大学药学院,吉林吉林 132013)

姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM),又称巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇,是一种可栽培的名贵食用真菌[1]。姬松茸含有多糖、甾醇类物质、核酸、脂质、外源凝集素、维生素等活性物质[2]。其中姬松茸多糖(Agaricusblazeipolysaccharide,ABP)是其主要活性成分之一,具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降低血糖、降低胆固醇、抗炎等功效,具有较高的药用价值[3-4]。据报道,D-半乳糖(D-gal)可引发拟衰老反应,导致免疫功能下降,对氧自由基代谢的损伤,造成与人体衰老基本一致的模型[5]。目前,姬松茸多糖对小鼠的免疫调节作用鲜有报道。大量文献表明食用菌多糖一般能够促进动物的脾脏和胸腺的发育[6-8],尤其对于还没有发育完善或已经受到某种免疫抑制的动物机体的免疫器官作用明显[9-11]。据报道,真菌多糖能够提高脾指数,促进机体非特异性免疫和淋巴细胞转化,提高血液循环中细胞因子含量,起到免疫调节作用[12-15]。

因此,本实验通过观察姬松茸多糖对小鼠胸腺、脾脏指数的影响,测定脾细胞增殖,并通过检测免疫细胞因子TNF-α和IL-6含量,探究姬松茸多糖的免疫调节作用,为进一步开发姬松茸免疫功能食品提供实验基础和理论依据,为姬松茸深入开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

姬松茸 沈阳聚鑫北虫草菌业有限公司;SPF级雄性ICR小鼠(4～5周龄,体重(20.0±2.0)g,40只,实验动物许可证编号为SCXK(吉)-2016-0003)、基础饲料 长春亿斯实验动物技术有限责任公司;葡萄糖标准品 Solarbio公司;D-半乳糖、D-Hank’s液、CCK-8 美国Genview公司;RPMI-1640培养基 塞默飞世尔生物化学制品有限公司;刀豆蛋白A(ConA) 美国Sigma公司;TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒 ABclonal公司。

UV-2550型紫外可见分光光度计 岛津国际贸易有限公司;Infinite M200型酶标仪 TECAN;恒温生化培养箱 上海博讯实业有限公司;SW-CJ-2D型双人净化工作台 上海苏净实业有限公司;LIFE Countess全自动细胞计数仪 美国Life Technologies公司;低温高速离心机 美国eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姬松茸多糖的提取 姬松茸子实体粉碎→无水乙醇除杂→滤渣→烘干至恒重→水浸提→过滤→浓缩→醇沉→Sevage法[16]除蛋白→透析→冷冻干燥→姬松茸多糖[17,18]。

操作要点:将姬松茸子实体常温粉碎,过60目筛。加入无水乙醇除杂,采用纱布进行滤渣,放入烘箱中烘干至恒重,设定一定的料液比、提取温度、提取时间、提取次数在恒温水浴锅中进行水提,过滤并收集滤液,采用旋转蒸发仪进行浓缩;用3倍体积的无水乙醇醇沉过夜;室温下进行Sevage法除去蛋白并过夜;用截留分子量为3500 Da的透析袋,于蒸馏水中透析48 h以除去小分子物质,-80 ℃冷冻干燥3 d,得到姬松茸多糖。

1.2.2 标曲的制作及多糖得率的计算 以葡萄糖为标准品(0.1 mg/mL),苯酚-硫酸法[19]测定冷冻干燥后固体样品多糖含量,根据标准曲线计算多糖得率。计算公式为:

多糖得率(%)=[(C×D×V)/(W×1000)]×100

式中:C-冷冻干燥样品多糖浓度(mg/mL);D-样品稀释倍数;V-样品体积(mL);W-样品质量(g)。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 温度对多糖得率的影响 固定反应条件为料液比1∶30 g/mL、提取时间为3 h、提取次数为3次,考察不同温度(60、70、80、90、100 ℃)对多糖得率的影响。

1.2.3.2 时间对多糖得率的影响 固定条件为料液比1∶30 g/mL、提取温度为80 ℃、提取次数为3次,考察不同提取时间(1、2、3、4、5 h)对多糖得率的影响。

1.2.3.3 料液比对多糖得率的影响 固定反应条件为提取温度80 ℃、提取时间为3 h、提取次数为3次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对多糖得率的影响。

1.2.3.4 提取次数对多糖得率的影响 固定每次反应条件为料液比1∶30 g/mL、提取温度80 ℃、提取时间为3 h,考察不同提取次数(1、2、3、4、5次)对多糖得率的影响。

1.2.4 正交试验 以单因素实验为基础,进行正交实验工艺设计,对姬松茸多糖得率影响的因素有提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取次数(D),详见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Level of form factors

1.2.5 实验动物模型建立及给药 本实验需雄性ICR小鼠40只,小鼠适应性喂养1周,实验期间小鼠自由饮食、饮水,动物室温度20.0～22.0 ℃,相对湿度50%～60%,将小鼠随机分成5组,即空白对照组(CON)、模型组(MOD)、姬松茸多糖低剂量组(ABP-L,200 mg/kg)、姬松茸多糖中剂量组(ABP-M,400 mg/kg)、姬松茸多糖高剂量组(ABP-H,800 mg/kg),每组8只。CON组颈部皮下注射生理盐水,其他各组均颈部皮下注射D-半乳糖溶液复制衰老模型,注射剂量为400 mg/kg。建立模型的同时灌胃给药,ABP-L、ABP-M、ABP-H组给予相应剂量姬松茸多糖(采用蒸馏水配制),CON与MOD给予等体积蒸馏水,连续注射及给药42 d。

1.2.6 测定小鼠脏器指数 末次给药后,禁食不禁水12 h后,对小鼠进行称重,使用摘除眼球方法收集血液,并脱颈处死小鼠,取出胸腺及脾脏称重,计算脏器质量与体重的比值(mg/g)。

脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/动物体重(g)

1.2.7 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应 试剂配制:RPMI培养液加入10%胎牛血清配成脾细胞培养液。用RPMI培养液配制成50 μg/mL ConA液,用0.22 μm的微孔滤膜过滤,分装后-20 ℃中存放备用。

脾细胞悬液的制备:实验在无菌操作室内进行,末次给药结束后将小鼠脱颈椎处死,并用75%的乙醇对小鼠进行消毒处理。在无菌操作台中解剖小鼠,在玻璃平皿中加入适量D-Hank’s液,用手术镊子轻轻夹住脾脏,剪掉周围组织,取出后将其放入平皿中。用注射器对脾脏进行研磨使其分散成单个细胞悬液,用移液枪吸取该细胞悬液，经200目筛网滤入离心管中,并用D-Hank’s液冲洗2次,1000 r/min离心10 min。离心后加入适量配制好的培养基,吹打细胞至均匀,用全自动细胞计数仪计脾细胞数,并调整其浓度为1×107个/mL。

淋巴细胞增殖反应:将脾细胞悬液转移到96孔培养板中,其中每个孔各加90 μL脾细胞悬液,分为两组,一组每孔加入10 μL ConA液,另一组设对照组,加入10 μL培养液,置5%CO2、37 ℃培养箱中培养48 h。每孔加入10 μL CCK-8,继续培养2 h。培养终止,用全自动酶标仪检测570 nm处的光密度(OD)值。

小鼠脾淋巴细胞的增殖转化(ΔOD570)=ODConA-OD无ConA

1.2.8 血清中TNF-a、IL-6含量测定 将小鼠摘除眼球取血后,离心取上清液。参照酶联免疫试剂盒说明书的方法测定TNF-α、IL-6的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

在490 nm波长处测定的吸光度值,以葡萄糖浓度为横坐标(mg/mL),吸光度值为纵坐标,绘制葡萄糖含量与吸光度的标准曲线见图1,计算得回归方程Y=14.662X-0.0041,决定系数R2=0.9997,线性关系良好。

图1 葡萄糖溶液标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

2.2 单因素实验结果

由图2可知,随着提取温度的升高,多糖得率呈上升趋势,在100 ℃时多糖得率最高,为了获得高得率的同时降低工业化生产的能耗,本实验选择提取温度80、90、100 ℃三个水平进行正交试验。由图3可得,多糖得率随着提取时间的延长而升高,提取时间高于3 h,多糖得率降低,可能由于提取时间较长会导致植物细胞壁结构破坏,使有效成分流出,造成多糖得率缓慢下降,因此选择临近的2、3、4 h三个水平进行正交试验。由图4可知,当料液比为1∶20 g/mL时,多糖得率最高,料液比偏小时,固液相中的有效成分的浓度差较小,会使溶液黏性增大,不利于姬松茸多糖的提取,随着料液比的增大,两相浓度差增大,多糖在溶剂中的量增大,但料液比过高时,浓度差过大,反而不利于多糖的溶出,因此选择1∶10、1∶20、1∶30 g/mL进行正交试验。由图5可知,当提取次数为3次时,多糖得率最高,随着提取次数的增加,消耗的材料和资源也较多,并且得率也受到影响,因此选择2、3、4次三个水平进行正交试验。

图2 提取温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

图3 提取时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharides yield

图4 料液比对多糖得率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on polysaccharides yield

图5 提取次数对多糖得率的影响Fig.5 Effect of extraction times on polysaccharide yield

2.3 正交试验结果

正交试验结果如表2。

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

根据表1中正交试验结果及极差分析可知,各因素对姬松茸多糖影响由大到小依次为提取温度>提取时间>料液比>提取次数。最佳因素的水平组合为A3B2C2D2。

根据姬松茸多糖提取最佳条件进行三次平行实验,姬松茸多糖平均得率为8.814%±0.109%。确定的最佳提取工艺与正交试验中的得率最高组接近,且重复性良好,进一步确定了提取姬松茸多糖的提取工艺A3B2C2D2,即料液比为1∶20 g/mL,100 ℃水浴浸提3次,每次3 h。

2.4 姬松茸多糖对小鼠脏器指数的影响

如图6、图7显示,与空白对照组相比,模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数极显著降低(p<0.01),说明建立模型成功。与模型组相比,姬松茸多糖低剂量组、中剂量组胸腺指数没有显著差异,而姬松茸多糖中剂量脾脏指数显著升高(p<0.05),姬松茸多糖高剂量组胸腺指数显著升高(p<0.05),脾脏指数极显著升高(p<0.01),说明姬松茸多糖高剂量组可以显著改善脏器指数,由于胸腺与脾脏作为免疫器官,直接能反应动物整体的健康良好状况,因此姬松茸多糖能够调节机体免疫功能。

图6 姬松茸多糖对小鼠胸腺指数的影响(n=8)Fig.6 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proportion of thymus in mice(n=8)注:与CON相比,#代表差异显著p<0.05,##代表差异极显著p<0.01;与MOD相比,*代表差异显著p<0.05,**代表差异极显著p<0.01;图7～图10同。

图7 姬松茸多糖对小鼠脾脏指数的影响(n=8)Fig.7 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on spleen specific gravity in mice(n=8)

2.5 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾脏淋巴细胞增殖转化结果

如图8所示,与空白对照组相比,模型组小鼠ConA诱导的淋巴细胞极显著降低(p<0. 01),表明建模成功。与模型组对比,姬松茸多糖低剂量组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖无显著性差异,姬松茸多糖中剂量组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖显著提高(p<0.05),姬松茸多糖高剂量组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖极显著提高(p<0.01)。说明增加姬松茸多糖剂量促进脾淋巴细胞增殖的作用增强,并显示量效关系,姬松茸多糖能够独立活化小鼠脾淋巴细胞增殖,并且能够协同促进ConA刺激的脾细胞增殖,侧面表明姬松茸多糖能够通过促进小鼠脾淋巴细胞的增殖而增强机体的免疫功能。

图8 姬松茸多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响Fig.8 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proliferation of mouse splenic lymphocytes

2.6 血清中TNF-α、IL-6含量测定结果

细胞因子是一类由活化的免疫细胞和相关细胞产生的高活性、具有多种生理功能的蛋白质多肽分子或糖蛋白,是免疫系统的重要组成部分[20],也是免疫系统调节营养代谢的主要介质,细胞因子含量的高低表明了免疫系统的自身代谢状态。TNF-α对免疫反应、机体代谢、炎症反应具有明显的调节和介导作用,可促进淋巴细胞增殖。IL-6是由单核细胞、激活的淋巴细胞及多种活性细胞分泌的具有生物活性物质,可诱导免疫细胞的增殖、分化,在活化、增殖的B细胞分化为浆细胞的过程中起关键作用,对机体的天然免疫和获得性免疫都具有重要的调节作用。

图9～图10显示,与空白对照组相比,模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6含量显著(p<0.05)减少;与模型组相比,随着姬松茸多糖剂量的增加,可促进血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且姬松茸多糖高剂量组能极显著(p<0.01)促进衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且TNF-α、IL-6的分泌趋势相近。说明姬松茸多糖可促进细胞因子TNF-α、IL-6的产生,从而促进淋巴细胞的增殖,有诱导免疫细胞的活化,最终调节机体的免疫功能。

图9 姬松茸多糖对衰老小鼠血清中TNF-α含量的影响Fig.9 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum TNF-α in aging mice

图10 姬松茸多糖对衰老小鼠血清中IL-6含量的影响Fig.10 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum IL-6 in aging mice

3 结论

采用水提醇沉法提取姬松茸多糖,通过单因素实验和正交实验筛选并优化姬松茸最佳提取工艺为:提取温度100 ℃,提取时间3 h,料液比1∶20 g/mL,提取次数3次,此时姬松茸多糖平均得率为8.814%±0.109%。小鼠注射D-半乳糖后,与空白对照组小鼠相比,胸腺指数和脾脏指数均极显著下降,经ConA刺激的模型组小鼠脾细胞增殖也同时受到抑制,说明D-半乳糖导致小鼠免疫力下降模型建立成功。与模型组相比,姬松茸多糖高剂量组极显著提高小鼠脾脏(p<0.01),显著提高胸腺指数(p<0.05),姬松茸多糖高剂量组极显著促进衰老小鼠脾细胞增殖(p<0.01),极显著增加衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6(p<0.01)含量。

本实验研究中姬松茸多糖能显著增加小鼠胸腺指数,并促进脾细胞增殖转化,促进小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌来调节免疫功能。因此姬松茸多糖对D-半乳糖诱导的衰老小鼠具有免疫调节作用,为开发姬松茸系列产品奠定理论和实践基础。