伊维菌素经AKT//MTOR信号通路激活自噬对结肠癌细胞生长的影响研究

陈立智，胡军，傅厚丰，符敏，虞道锐

1琼海市人民医院普通外科，海南 琼海 571400

2海南医学院机能实验室，海口 571199

据《2015中国肿瘤登记年报》数据显示，结直 肠癌的发病率和病死率在所有肿瘤中均位居第5位[1]。2000—2014年全球肿瘤生存率变化趋势监测研究报告显示，中国结肠癌患者的5年净生存率仅为56.9%，明显低于美国、韩国、日本等发达国家[2]。因此结肠癌的诊治工作成为亟待解决的社会公共卫生问题。目前在美国国立综合癌症网 络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南上结肠癌的治疗方式主要以手术切除和放化疗为主[3]，但手术切除的并发症多、放化疗的不良反应大一直是治疗结肠癌的难题，寻找新的肿瘤治疗方法一直是近年来医学领域的重点研究课题。伊维菌素（Ivermectin）是由阿维链霉菌发酵产生的半合成大环内酯类多组分抗生素[4]，是新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药物，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好的驱杀作用[5]。近年来，伊维菌素被证实可抑制白血病和卵巢癌细胞的生长，也可通过降低蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycinm，MTOR）信号通路的活性诱导线粒体功能障碍和氧化应激抑制胶质母细胞瘤的生长和血管生成[6-8]，这表明伊维菌素作为抗肿瘤药物具有很大的发展潜力。据多项研究报道，肌醇六磷酸、喹唑啉酮、汉黄芩苷等多种药物均能够降低AKT/MTOR通路的活性从而抑制结肠癌细胞的生长[9-11]，这提示AKT/MTOR信号通路是结肠癌药物治疗的重要靶点之一。因此，本研究探讨伊维菌素是否能够抑制结肠癌细胞株HCT-116、SW-480的生长及其作用机制是否与AKT/MTOR信号通路有关，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料

人结肠癌细胞株SW-480、HCT-116均购自中国科学院上海细胞库。伊维菌素购自美国Sigma公司，RPMI1640培养基、0.25%Trypsin-EDTA（1X）胰酶、青链双抗、胎牛血清均购自美国Gibco公司，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒、膜联蛋白V（AnnexinV）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均购自中国上海碧云天生物科技公司，Anti-微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）、Anti-p62、Anti-微管相关蛋白1轻链 3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Anti-AKT、Anti-磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylation AKT，p-AKT）、Anti-MTOR、Anti-磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation MTOR，p-MTOR）、Anti-beta actin抗体、兔二抗均购自美国Abcom公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测结肠癌细胞活性 选取处于对数生长期的人结肠癌细胞株SW-480、HCT-116，0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度按每孔5×103/100µl接种于96孔板，待细胞贴壁后，给予梯度浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μmol/L的伊维菌素溶液处理，同时设置不给药的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）为对照组，每组设5个复孔。于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，于终止培养前4 h加入10 μl MTT（5 mg/ml），继续37℃孵育4 h弃去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，在570 nm下测定吸光度（optical density，OD）值。

1.2.2 流式细胞术检测结肠癌细胞凋亡情况 选取处于对数生长期的人结肠癌细胞株SW-480、HCT-116，按1×105/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后分别给予伊维菌素5、10 μmol/L以及PBS处理，24 h后进行细胞凋亡检测。用0.25%胰酶消化并收集细胞，800 r/min离心3 min，弃上清，收集细胞，用PBS重悬细胞并计数。取105个重悬的细胞，800 r/min离心3 min，弃上清，加入195µl AnnexinV-FITC结合液重悬细胞，然后先后分别加入 Annexin V/FITC和 PI，室温避光孵育 10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞各期凋亡率。

1.2.3 免疫荧光检测结肠癌细胞内自噬相关蛋白LC 3-Ⅱ的表达水平 采用0、5 μmol/L伊维菌素按1.2.2步骤处理细胞24 h后，PBS清洗细胞3次，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗，0.1%Triton 100室温破裂细胞膜20 min，PBS清洗，1%胎牛血清室温封闭30 min，PBS清洗，加入一抗（根据说明书确定稀释比例），4℃过夜，PBS清洗3次，加入Alexa Flour二抗（根据说明书确定稀释比例），4℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入10 ng/ml DAP（I1∶500），4℃避光孵育20 min，PBS清洗3次；倒置荧光显微镜下拍照。

1.2.4 透射电镜观察细胞内自噬体形成 采用0、5 μmol/L伊维菌素按1.2.2步骤处理细胞24 h后，收集（2×105）～（1×106）个细胞，离心弃上清。用PBS洗涤1次，离心弃上清，20倍样品体积以上的2.5%戊二醛PBS固定4 h，0.1 mol/L PBS（用量0.5～1.0 ml）漂洗15 min 2次，1%锇酸固定液固定1 h，ddH2O漂洗10～15 min 2次，2%醋酸铀固定/染色30 min，乙醇梯度脱水，渗透，包埋，聚合，用超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜观察细胞内自噬体形成情况。

1.2.5 Westernblot法检测蛋白表达情况 为确定伊维菌素能否诱导结肠癌细胞自噬，本研究采用蛋白质印迹法（Western blot）检测自噬标志蛋白LC-3Ⅱ、p62蛋白表达情况。采用0、5、10 μmol/L伊维菌素按1.2.2步骤处理细胞24 h后收集细胞，提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度，加入5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）加样缓冲液混合，95%变性10 min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，根据说明书确定稀释比例加入兔抗人Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p62、Anti-AKT、Anti-p-AKT、Anti-MTOR、Anti-p-MTOR、Anti-beta actin抗体，4℃孵育过夜，洗膜后按1∶2000加二抗，室温孵育2 h，洗膜，采用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒曝光，Quantity One图像分析软件分析目的条带和内参条带的OD值，蛋白表达的灰度值用Image J软件测定，计算蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 伊维菌素对结肠癌细胞活性的影响

伊维菌素对HCT-116、SW-480结肠癌细胞的生长均有明显抑制作用，细胞活力均随伊维菌素浓度的升高而降低（F=90.85、2518.61，P＜0.01）。（表1）

表1 不同浓度的伊维菌素作用于结肠癌SW-480、HCT-116细胞24 h后细胞OD值的比较（±s）

表1 不同浓度的伊维菌素作用于结肠癌SW-480、HCT-116细胞24 h后细胞OD值的比较（±s）

注：与伊维菌素浓度为0 μmol/L细胞比较，aP＜0.05，bP＜0.01

伊维菌素浓度（μmol/L）0 2.5 5.0 10.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 HCT-116细胞1.27±0.10 1.22±0.08 1.11±0.11 0.87±0.09a 0.62±0.07b 0.40±0.06b 0.18±0.01b 0.08±0.02b 0.06±0.01b SW-480细胞1.15±0.01 1.11±0.01b 1.04±0.03b 0.90±0.00b 0.51±0.02b 0.10±0.01b 0.08±0.01b 0.08±0.01b 0.06±0.00b

2.2 伊维菌素对结肠癌细胞凋亡的影响

5、10 μmol/L伊维菌素作用于HCT-116结肠癌细胞后，细胞凋亡率均明显高于0 μmol/L伊维菌素，差异均有统计学意义（t=-12.887、-26.458，P＜0.01）；5、10 μmol/L伊维菌素作用于SW-480结肠癌细胞后，细胞凋亡率均明显高于0 μmol/L伊维菌素，差异均有统计学意义（t=-15.618、-18.643，P＜0.01）。（表2）

表2 不同浓度的伊维菌素作用于SW-480、HCT-116结肠癌细胞24 h后的细胞凋亡率（%，±s）

表2 不同浓度的伊维菌素作用于SW-480、HCT-116结肠癌细胞24 h后的细胞凋亡率（%，±s）

伊维菌素浓度（μmol/L）HCT-116细胞SW-480细胞051 0 3.10±0.51 12.67±0.92 21.77±0.86 3.40±0.91 17.67±0.92 20.63±0.94

2.3 伊维菌素对结肠癌细胞中自噬标志蛋白LC- 3Ⅱ、p 62表达的影响

免疫荧光实验结果显示，5、10 μmol/L伊维菌素作用于结肠癌细胞HCT-116和SW-480 24 h后，与0 μmol/L伊维菌素相比，结肠癌细胞HCT-116和SW-480内LC-3Ⅱ荧光强度均明显增加，且随伊维菌素浓度的升高荧光强度逐渐增强（图1）。

5、10 μmol/L伊维菌素作用于结肠癌细胞HCT-116、SW-480后，与0 μmol/L伊维菌素相比，结肠癌HCT-116细胞LC-3Ⅱ蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（t=-4.18、15.46，P＜0.01）；p62蛋白相对表达量均降低，差异均有统计学意义（t=-2.53、3.20，P＜0.05）；结肠癌SW-480细胞LC-3Ⅱ蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（t=-5.23、6.65，P＜0.01）；p62蛋白相对表达量均降低，差异均有统计学意义（t=-2.01、3.47，P＜0.05）（图2、表3）。

图1 免疫荧光法检测HCT-116、SW-480结肠癌细胞内LC- 3Ⅱ的表达

图2 Western blot法检测HCT-116、SW-480结肠癌细胞内LC- 3Ⅱ、p62蛋白表达情况

表3 不同浓度的伊维菌素作用于SW-480、HCT-116结肠癌细胞24 h后LC- 3Ⅱ、p62蛋白的相对表达量（±s）

表3 不同浓度的伊维菌素作用于SW-480、HCT-116结肠癌细胞24 h后LC- 3Ⅱ、p62蛋白的相对表达量（±s）

0 5 1 0 HCT-116 LC-3Ⅱ0.28±0.01 0.37±0.04 0.49±0.02 p62 0.89±0.09 0.69±0.10 0.54±0.16 SW-480 LC-3Ⅱ0.13±0.01 0.21±0.02 0.28±0.03 p62 0.71±0.11 0.54±0.08 0.36±0.12

2.4 伊维菌素对结肠癌细胞中自噬体形成的影响

采用透射电镜观察细胞内自噬体的数量，结果显示，5 μmol/L伊维菌素处理结肠癌HCT-116和SW-480细胞24 h后，与0 μmol/L伊维菌素相比，HCT-116、SW-480结肠癌细胞内自噬体的形成明显增多。（图3）

图3 透射电镜下观察HCT-116、SW-480结肠癌细胞内自噬体的形成数量（×8900）

2.5 伊维菌素对AKT/MTOR通路蛋白表达情况的影响

5、10 μmol/L伊维菌素处理细胞24 h后p-AKT和p-MTOR蛋白表达均低于0 μmol/L伊维菌素，且随伊维菌素浓度的升高而降低，呈剂量依赖性，提示伊维菌素能够抑制AKT/MTOR通路。（图4）

图4 Western blot法检测伊维菌素处理后结肠癌细胞内AKT、MTOR、p-AKT和p-MTOR蛋白的表达

3 讨论

本研究结果证实了伊维菌素能够诱导结肠癌细胞自噬从而抑制其生长，诱导结肠癌细胞产生自噬的调控机制是通过抑制AKT/MTOR通路磷酸化水平的表达。自噬在一定程度上对细胞来说具有维持细胞能量循环的作用，当自噬激活增加时可诱导细胞发生自噬性死亡，这也是多种抗肿瘤药物的作用途径之一。

自噬过程主要可以分为3个步骤，首先当细胞受到自噬诱导信号调控时细胞质成分被吞噬细胞或特异隔离膜包围起来形成双脂层、半球形的吞噬泡。随后吞噬泡不断地延伸将细胞质内的线粒体和内质网碎片等成分包裹起来形成密闭的球状自噬体，此过程中LC3-Ⅱ蛋白在自噬前体和自噬体的内外膜均有表达，在膜外表达的LC3-Ⅱ脱离自噬体入细胞质，因此LC3-Ⅱ是自噬形成的标志性蛋白之一[12]。最后成熟的自噬体在选择性自噬接头蛋白p62的作用下与溶酶体融合并在溶酶体中降解自噬体内容物[13]。在本研究中，采用伊维菌素处理结肠癌细胞24 h后，发现LC3-Ⅱ蛋白的表达升高、p62蛋白的表达降低。透射电镜结果也表明伊维菌素处理结肠癌细胞后，细胞内有大量的自噬体形成。这两个实验结果均表明伊维菌素可诱导细胞内自噬体增加。但自噬是一个动态过程，细胞内自噬体的增加可能是自噬体与溶酶体融合受阻，也有可能是自噬持续产生。所以今后的研究工作需要证实伊维菌素诱导细胞内自噬体增加的作用是阻碍自噬体与溶酶体结合还是促进自噬。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是促进细胞存活和维持细胞正常功能的关键信息分子[14]。研究表明AKT可通过调控多种转录因子，将信号向下传递至MTOR，MTOR可通过AKT磷酸化而被激活，磷酸化的MTOR不仅可以加速细胞周期也可以通过清除泛素蛋白从而抑制自噬的发生，因此AKT/MTOR信号通路与细胞内自噬的产生有着重要的调控作用[15-16]。本研究通过检测细胞内AKT/MTOR通路蛋白磷酸化水平的表达情况来探讨伊维菌素诱导细胞自噬的分子机制。结果表明，伊维菌素各剂量组均可抑制结肠癌细胞内p-AKT、p-MTOR的蛋白表达，表明伊维菌素可以抑制AKT/MTOR通路的活化，这与Dou等[17]报道的伊维菌素可以通过调控AKT/MTOR信号通路发挥抗乳腺癌作用的结果一致，提示伊维菌素抑制AKT/MTOR通路的活化是伊维菌素诱导结肠癌细胞发生自噬抑制结肠癌细胞生长的作用机制之一。但此作用在后期的研究中将利用AKT稳定表达于结肠癌细胞株进一步验证。

综上所述，伊维菌素可通过诱导结肠癌细胞自噬从而发挥抗结肠癌作用，其机制可能与抑制AKT/MTOR通路的活化有关。但在后期的研究中还需要利用更多的实验方法对此作用机制进行充分的认证，为结肠癌的临床治疗及药物研究提供依据。