载脂蛋白E启动子区域-427T/C多态性与冠心病的关系及其对转录活性的影响

张蕊，赵辉，赵福梅，任珉，刘婷，刘珊，丛洪良2，△

动脉粥样硬化和脂质代谢紊乱是冠心病（CHD）的基本病理基础，参与脂蛋白合成和代谢的载脂蛋白在冠心病和脑血管病易感性中起着重要的作用［1-2］，其中有关载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）的研究最为广泛。作为一种重要的配体蛋白，APOE 通过结合肝细胞或其周围细胞上的相应受体，一方面介导乳糜微粒的内吞，另一方面参与三酰甘油（TG）的分解代谢，介导含有APOE 的脂蛋白和脂质复合体与低密度脂蛋白（LDL）受体、LDL 受体相关蛋白（LRP）、极低密度脂蛋白（VLDL）受体、APOE 受体的相互结合，进而参与血浆和组织脂质的稳态控制［3］。同时APOE 还可通过抑制血小板源生长因子（PDGF）诱导平滑肌细胞（SMC）迁移和增殖，限制新生血管内膜增生［4］。随着研究的深入，APOE基因启动子区域-219G/T、-427T/C、-491A/T位点多态性逐渐受到关注［5-6］。该区域可通过调控APOE基因的表达来影响疾病的转归。目前对-427T/C位点与冠心病的关系及其对转录活性的影响尚鲜见大样本报道，因此，本研究采用病例对照研究方法，分析APOE-427T/C 基因多态性与脂蛋白代谢、冠心病发病风险的关系及其对APOE 转录活性的影响，正确评价APOE的临床意义，为动脉粥样硬化的防治开辟新途径。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 选取2016年10月—2017年9月天津市胸科医院心内科因胸闷、胸痛入院的患者627例，根据冠状动脉造影（CAG）结果分为CHD 组（415 例）和非CHD（212例）。CHD 组男270 例，女145 例，平均年龄（62.00±9.85）岁，包括急性冠脉综合征103 例和稳定性冠心病患者312 例。CHD 患者符合1979 年WHO 诊断标准，并经CAG 检查［7-8］证实左前降支、左回旋支、右冠状动脉中至少1 支狭窄直径≥50%。非CHD 组男88 例，女124 例，平均年龄（59.08±8.96）岁，均经心电图、血液检查、心脏超声及CAG 检查排除冠心病。所有受试者均除外非汉族人群、严重肝肾疾病、甲状腺亢进或减退、外周血管疾病、炎症性疾病、肿瘤、既往血运重建、全身免疫性疾病及其他合并严重合并症者，且既往未服用调脂药物。本研究入选患者均知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血脂及生化指标测定 入院后采集空腹12 h 静脉血并分离血清。酶法测定总胆固醇（TC）、TG、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、脂蛋白a［Lp（a）］、载脂蛋白AI（APOAI）、载脂蛋白B（APOB）、同型半胱氨酸（HCY）和尿酸（UA）水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定APOE水平。

1.2.2 巢式PCR 扩增APOE-427T/C 基因 采集患者空腹静脉血5 mL，EDTA 抗凝，分离白细胞，Triton 低渗缓冲液溶血法提取基因组DNA。采用巢式PCR 扩增APOE 启动子-427T/C 目的基因片段。第1 次PCR 引物序列：上游5'-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3' ，下游 5'-TCCAAT CGACGGCTAGCTACC-3'。PCR 反应体系25 μL：反应预制混合液12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次；72 ℃延伸7 min。扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。第2 次PCR 引物序列：上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3'，下游5'-CCTCCTTTCCTGACCCTGTCC-5'。反应体系25 μL：预制混合液12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，第1 次PCR 产物3 μL，ddH2O 8.5 μL，反应条件同第1次扩增反应。扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物采用AluⅠ酶切，根据酶切结果分为纯合突变型CC（228 bp）、野生型TT（144 bp，84 bp）；杂合突变型TC（228 bp，144 bp，84 bp）3 型，分型后采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验样本代表性。

1.2.3 体外实验

1.2.3.1 主要实验材料 荧光报告基因pGL2-Basic、大肠杆菌感受态细胞DH5α、TaqDNA聚合酶均为天津市心血管病研究所馈赠。T4DNA连接酶（上海生工生物工程有限公司）、限制性核酸内切酶SacI、BglII（Fermentas 公司）、293T细胞（上海和元生物科技）、质粒（高纯度）中量提取试剂盒（OriGene）、脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司）、双荧光素酶检测试剂盒（E1910，Promega）。

1.2.3.2 APOE-427T/C 目的基因片段的获得、连接、鉴定和293T细胞转染 参照PCR后酶切结果，选择载脂蛋白启动子区-427位点的TT和CC纯合子基因型，采用巢式PCR对所需片段进行大规模扩增。纯化回收PCR 产物，将其与pGL2 载体连接。鉴定连接正确后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，限制性内切酶SacⅠ、BglⅡ对重组质粒进行酶切鉴定，并进行DNA序列测定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000 将pGL2-APOE-427TT（TT 组）、pGL2-APOE-427CC 重组质粒（CC 组）、对照组质粒pGL2-Basic（对照组）分别和内参质粒pRL-CMV共转染293T细胞。

1.2.3.3 APOE转录活性测定 采用双荧光素酶报告基因检测报告基因系统［9-10］检测3组细胞的荧光强度。细胞转染培养48 h后裂解细胞，离心后收集裂解液，取20 μL细胞裂解液与100 μL LARII混合，荧光发光检测仪读取10 s的发光强度值，此为萤火虫荧光素酶催化产生的发光强度，代表启动子的活性。再加入100 μL Stop&Glo 混合，在荧光发光检测仪读取10 s 的发光值，即为海肾荧光素酶催化产生的发光强度。计算不同重组质粒荧光素酶相对荧光强度，以反映APOE的转录活性。计算公式如下：（萤火虫荧光素酶发光强度-空白孔发光强度）/（海肾荧光素酶发光强度-空白孔发光强度）［11］。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 16.0 进行统计学处理，Graph Pad 5.0 作图。符合正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t法（方差齐）或Dunntt's T 法（方差不齐），不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用2 样本Kolmogorov-SmirnovZ检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用非条件Logistic 回归分析冠心病发病的危险因素，并计算比值比（OR）和95%可信区间（CI）。双侧检验P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料比较 与非CHD组相比，CHD组年龄、吸烟比例、男性比例、糖尿病比例、TG、Lp（a）、HCY、UA 均出现升高，HDL-C、APOAI 水平则降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），2组间TC、LDL-C、APOB 及APOE 差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 APOE-427T/C 基因多态性分析 2组APOE-427T/C 基因多态符合Hardy-Weinberg 平衡（χ2=1.698，P＞0.05），具有群体代表性。与非CHD 组相比，CHD 组C 等位基因频率升高（P＜0.01），见表2。巢式PCR扩增后酶切结果见图1。

2.3 APOE-427T/C 基因多态性对血脂及载脂蛋白水平影响 非CHD 组中，TC+CC 型与TT 型患者血脂及载脂蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；CHD 组中，与TT 型比较，TC+CC 型患者血清APOB水平升高（P＜0.05）、APOA/B 水平降低（P＜0.05），其他指标比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 CHD 发病危险因素的多因素Logistic 回归分析 根据单因素分析结果，以有无CHD（有=1，无=0）为因变量，以吸烟（有=1，无=0）、糖尿病（有=1，无=0）、TG、UA、HCY、APOE-427T/C 基因型（TT=1，TC+CC=2），APOE水平为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果表明吸烟、糖尿病、UA升高、APOE-427 C等位基因是CHD发生的危险因素，见表4。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups表1 CHD组和非CHD组一般资料的比较

Tab.2 Comparison of APOE-427T/C genotype and allele frequency between two groups表2 APOE-427T/C基因型频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡性的检验和等位基因频率比较

Tab.3 Comparison of serum lipids and apolipoprotein levels of different genotypes of APOE-427T/C between the two groups表3 2组内APOE-427T/C不同基因型血脂及载脂蛋白水平的比较

Fig.1 Electrophoretogram of AluI fragment of APOE-427T/C site图1 APOE-427T/C位点AluI酶切片段电泳图

Tab.4 Multivariate Logistic regression results of risk factors for CHD表4 CHD危险因素多因素非条件Logistic回归结果

2.5 APOE-427T/C 基因多态性对APOE 转录活性的影响 3 组间APOE 蛋白转录活性比较差异有统计学意义（F=85.30，P＜0.01）；CC组APOE转录活性明显低于TT组（P＜0.05），见图2。

Fig.2 Comparison of APOE transcription activities between three groups图2 3组细胞APOE转录活性比较

3 讨论

人APOE基因位于19号染色体长臂13区的2带（19q132），大小约3.7 kb。该基因包含4个外显子和3 个内含子［12-13］。APOE 的前体由317 个氨基酸组成，经信号肽剪切形成299 个氨基酸的成熟蛋白。而编码APOE 肽链上的第112 位和第158 位氨基酸相对应的核苷酸存在差异，可翻译成3 种不同的蛋白异构体：apo ε2、apo ε3 和apo ε4，其对应的6 种基因型分别：ε2 ε2、ε2 ε3、ε3 ε4、ε3 ε3、ε2 ε4、ε4 ε4［14］。APOE基因转录起始点上游的启动子调控着基因表达的起始时间和表达程度，如果该区域的DNA序列发生变化，可能会影响APOE的转录和表达，最终对APOE 的蛋白表达水平产生影响。目前已经在近端启动子区域中鉴定了几个单核苷酸多态性，其中-219G/T、-427C/T、-491A/T 位点最为重要［15］。既往Bañares 等［16］检测了APOE-427T/C 位点多态性与脂质谱和冠状动脉粥样硬化的关系，发现在60岁以下的女性中，携带APOE-427 C等位基因的TG 水平较不携带者明显升高。本研究结果显示，CHD 组中，与TT 基因型比较，TC+CC 基因型APOB 水平升高；同时CHD组C等位基因频率明显高于非CHD组，推测该位点基因变异是冠心病的遗传易感基因；Logistic回归分析结果表明APOE-427 C等位基因也是CHD 发生的危险因素，提示APOE 基因-427T/C位点基因多态性与冠心病的发病存在明显相关性。

Ozturk 等［17］研究了331 例高加索人和215 例非洲裔美国人，通过双荧光素酶报告基因分析发现APOE-491 T 等位基因导致APOE 启动子活性显著下降，并且位于该核苷酸周围的序列均参与APOE转录的调节，但是该研究并未指出-427 T/C 位点的启动子多态性影响APOE转录活性。本研究体外实验结果显示，APOE-427 TT 型的APOE 转录活性较CC 型升高，提示APOE-427T/C 可能是一个功能性位点，它可通过调节APOE 的转录活性，影响APOE的功能。

APOE-427T/C 位点基因多态性对冠心病影响主要以下几方面：（1）APOE 通过和受体结合，参与血脂代谢，从而使乳糜微粒和极低密度脂蛋水平下降，生成LDL-C 增加，故胆固醇浓度升高。（2）从肠道吸收的胆固醇是血浆脂质主要来源，APOE 可通过小肠吸收胆固醇，其吸收的效率应由APOE 活性及水平决定，APOE 活性则由启动子多态性决定，从而影响血浆胆固醇含量。（3）APOE可以促进HDL-C的形成，从而介导HDL 在肝脏内的分解，从而完成了胆固醇的转运，最终影响血浆胆固醇的含量。（4）人体摄入脂肪后，脂蛋白之间APOE 蛋白的转移以及脂蛋白转化和生成速率都取决于APOE 活性，活性改变导致高胆固醇血症和促动脉粥样硬化的循环中的脂蛋白胆固醇重新分布。本研究显示APOE基因多态性通过改变了含有APOE 和APOB 介导的脂蛋白与肝脏的结合、摄取和分解代谢，以及肠道胆固醇吸收，胆汁酸形成和内源性胆固醇合成，最终影响血浆脂蛋白的水平。

APOE-427 C 等位基因携带者是冠心病发病的危险因素，该位点通过影响APOE 的转录活性及合成水平，进而影响血浆脂蛋白浓度及冠心病的发病。