凤丹种荚提取物抗菌活性研究

赵国栋

摘要    比较凤丹种荚水提取物和乙醇提取物的抗菌活性，对凤丹种荚的水提取物和乙醇提取物进行体外抗细菌和真菌的活性试验，测定比较其最小抑菌浓度（MIC）。结果表明，2种提取物对所选取的4种细菌均具有一定的抑菌效果，乙醇提取物的抑菌活性强于水提取物。2种提取物未表现出抑制真菌黑曲霉的活性，其最小抑菌浓度均大于2 mg/mL。由此说明，凤丹种荚提取物对细菌有一定的抑菌效果，具有一定的开发应用价值。

关键词    牡丹;凤丹;种荚;抗菌活性;最小抑菌浓度

中图分类号    S565.9;R285.5        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）13-0200-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Study  on  Antibacterial  Activity  of  Pod  Extracts  of  Paeonia  ostii

ZHAO Guo-dong 1，2

（1 Luoyang National Peony Garden，Luoyang Henan 471011; 2 National Peony Gene Bank）

Abstract    To compare the antibacterial activity of water extracts and ethanol extracts from seed pods of Paeonia ostii，the in vitro antibacterial and antifungal experiments on water extracts and ethanol extracts from seed pods of Paeonia ostii were conducted，and the minimum bacteriostatic concentrations（MIC） were determined and compared. The results showed that the two extracts both had inhibitory effects on the 4 kinds of bacteria，and the antibacterial activity of ethanol extracts were better than the water extracts. The two extracts showed no inhibition activity on fungal Aspergillus niger，and their MIC was more than 2 mg/L. In summary，the extracts from seed pod of Paeonia ostii has antibacterial effect，and it has potential value in developed and application.

Key words    Paeonia suffruticosa Andr.;Paeonia ostii;seed pod;antibacterial activity;minimum bacteriostatic concentration

植物是生物活性化合物的天然寶库。国外学者Wilkins和Board曾经报道，有1 389种植物可以作为杀菌剂、防腐剂的提取来源[1]，约2 400种植物具有控制有害生物活性的作用[2]，而植物产生的次生代谢产物超过400 000种[3]，其中多数化合物如多酚、黄酮、生物碱、萜烯类和有机酸类均具有抗菌性或杀虫活性。然而，目前研究开发的植物种类仅仅占比10%，大量潜在的具有活性的植物种类或材料亟待开发利用。

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组落叶灌木，原产中国，是我国十大名花之首，素有“百花之王，国色天香”的美誉，历来为世人所喜爱。牡丹全身都是宝，其根、皮、花、叶、种子均可被利用[4]。2011年，国家卫生部批准凤丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）牡丹和紫斑（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Li et D.Y.Hong）牡丹籽油作为新资源食品。牡丹籽油含有丰富的不饱和脂肪酸，具有重要的保健价值和药用价值[5]。油用牡丹作为新兴木本油料作物，已被列入国家林业“十三五”发展规划重点林业工程，截至2016年，全国已发展到6.67万hm2以上。

油用牡丹果实是蓇葖果，一般每个蓇葖果有3～5个果荚，成熟的牡丹果荚外壳比较致密坚硬。牡丹种荚作为油用牡丹的副产品，随着油用牡丹种植规模的扩大，其产量逐步增加。根据测算，每生产100 kg牡丹籽会产出50～60 kg种荚。然而，在生产过程中大量的牡丹种荚被废弃，造成了资源浪费。

为了变废为宝，开展了种荚的综合利用。本研究以油用牡丹凤丹种荚为原料，研究其提取物的抗菌活性，探讨其作为食品防腐剂的可能性，以期为凤丹种荚资源的综合利用提供依据[6-7]。

1    材料与方法

1.1    试验材料

供试油用牡丹凤丹果荚采自国家牡丹基因库油用牡丹圃，系自育的八年生凤丹，8月上旬蓇葖果开裂后采收，果荚内种子脱离后外壳用于提取和抗菌试验[8-9]。

试验菌种为大肠杆菌Escherichia coli（CCAM080173）、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus（CCAM080177）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（CMCC63501）、黑曲霉Aspergillus niger（CCAM080002）。

1.2    仪器与试剂

供试仪器：MP10001电子天平（上海恒平科学仪器有限公司生产）;LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂生产）;SA-JZ多功能超净工作台（上海稼丰园艺用品有限公司生产）;QTSXR10260超声波清洗仪（天津市瑞普电子仪器公司生产）;PGX-280A-22H型生化培养箱（宁波莱福科技有限公司生产）。

供试试剂：盐酸四环素、蛋白胨、琼脂（Sigma）;二甲基亚砜DMSO、氯化钠以及蔗糖（上海浩洋生物科技有限公司生产）。

1.3    凤丹种荚粗提物制备

将凤丹种荚漂洗之后自然晾干剪碎，于60 ℃恒温箱中烘干至恒重，用中药粉碎机粉碎后过20目筛，准确称取粉末40 g，平均分成2份。一份加入5倍体积的蒸馏水浸提24 h，并每隔2～3 h搅拌混匀1次，浸提之后过滤2次，上清液于8 000 r/min离心15 min，去除沉淀并浓缩，灭菌后4 ℃保存备用;另外一份以乙醇作为提取溶剂，滤渣重复提取2次，合并滤液，减压旋转蒸发溶剂，浓缩后冻干12 h，得乙醇粗提物[10-11]。

1.4    提取物样品的制备

称取预先干燥后的凤丹种荚醇提物和水提物，称定后分别用5% DMSO溶解配制成8 mg/mL溶液备用，并且在每次取用前均用超声充分分散均匀。

1.5    菌悬液及孢子悬液的配制

将各细菌菌种接种于LB固体培养基上，在37 ℃传代培养2次进行活化，挑取活化好的细菌用无菌生理盐水配制成菌悬液，按10倍浓度梯度进行稀释后进行平板菌落计数，计算出原菌悬液的浓度并在此基础上稀释成1×108 CFU/mL菌悬液备用;真菌采用PDA培养基培养至产生大量孢子，再用无菌生理盐水将菌丝上的孢子洗脱后配制成菌悬液，用血球计数板计数，并稀释成1×106个/mL孢子悬液备用[12-13]。

1.6    抗细菌活性的测定

1.6.1    最小抑菌浓度（MIC）的测定。取各个极性部位提取物溶液100 μL采用2倍稀释法用无菌水稀释成一系列浓度梯度。取1 mL的1×108 CFU/mL各细菌菌悬液加入至9 mL的LB液体培养基中混匀得相应的培养基菌悬液，在每管中分别加入100 μL培养基菌悬液，各管中提取物质量浓度依次为2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，以无菌水为空白对照，置于37℃的恒温培养箱中培养24 h后观察，以目视无菌生长的孔对应最低浓度为最小抑菌浓度。

1.6.2    牛津杯法测定对细菌抑制活性。取制备好的细菌悬液100 μL，加入到含LB固体培养基的平皿表面，用涂布棒涂布均匀。等距放上4个灭菌的牛津杯（10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm）于含菌平板上，分別加入样液100 μL，以50 μg/mL盐酸四环素为阳性对照将平板置于37 ℃恒温箱培养，测量抑菌圈直径的大小，其中枯草芽孢杆菌培养18 h、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养24 h后测量结果。每个提取物平行做3个重复。

1.7    抗真菌活性测定

取各提取物溶液100μL采用2倍稀释法用无菌水稀释成一系列浓度梯度。取1 mL的1×106个/mL的各孢子悬液加入至9 mL的PDB培养基中，混匀得相应的培养基菌悬液，在每管中分别加入100 μL培养基孢子悬液，各管中提取物质量浓度依次为2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，以无菌水为空白对照，置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h后观察菌丝生长情况，中心无菌丝生长的孔对应的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

2    结果与分析

2.1    不同提取物对细菌的抑菌活性

最小抑菌浓度（MIC）的测定结果如表1所示。从结果来看，凤丹种荚乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制活性均为0.5 mg/mL;凤丹种荚水提物具有一定的抑菌活性，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.0 mg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为为2.0 mg/mL。

牛津杯法测定对细菌具有抑制活性，阳性对照药物50 μg/mL盐酸四环素显示出了对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性，抑菌圈直径为（10.70±0.50）mm;试验测试凤丹种荚水提物未有明显的抑菌圈，抑菌直径为（0.07±0.00）mm;凤丹种荚乙醇提物在8 mg/mL浓度下表现出微弱的抑菌活性，其抑菌圈直径为（1.27±0.00）mm。

2.2    不同提取物对真菌的抑菌活性

对凤丹种荚乙醇提取物和水提取物抗食品腐败真菌黑曲霉活性进行测定，结果发现，测试的样本均没有表现出抑制真菌孢子萌发的活性，2种提取物对黑曲霉的最小抑菌浓度（MIC）均大于2 mg/mL。

3    结论与讨论

凤丹是油用牡丹主要推广栽培的种类。本文以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试细菌，研究了牡丹种壳提取物对食品腐败相关的细菌和真菌的抑制活性，结果表明，牡丹种荚乙醇提取物和水提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有一定的抑菌活性，其中乙醇提取物的抑菌活性强于水提物。采用牛津杯法测定牡丹种荚提取物对细菌的抑制活性，在凤丹种荚醇提物8 mg/mL浓度下体现出了微弱的抑菌活性，其抑菌圈直径为（1.27±0.00）mm。2种提取物对食品腐败真菌黑曲霉均没有抑菌活性。

本试验仅对凤丹种荚乙醇萃取相、水萃取相进行抑菌活性分析，尚未开展其他溶剂萃取相的抑菌活性分析，其活性成分有待进一步分析鉴定。本研究可为凤丹种荚的综合利用提供数据支撑。

4    参考文献

[1] 吴轶青.使用天然抗菌化合物保护作物[J].农药译丛，1996，18（3）：9-12.

[2] GRANG M，AHMED S.Handbook of plangts with prst control [M].American：Miss Univ Press，1988.

[3] SWAIN T.Secondery compounds as protective agents[J].Annual Review of Plant Melecular Biology，1977，28：479-491.

[4] 李逵，周宁，李赫宇.牡丹花、牡丹籽成分与功能研究进展[J].食品研究与开发，2012，33（3）：228-230.

[5] 周海梅，马锦琦，苗春雨，等.牡丹籽油的理化指标和脂肪酸成分分析[J].中国油脂，2009，34（7）：72-74.

[6] 王斌利，张莉霞，石晓峰，等.紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物抗氧化能力研究[J].中国中医药信息杂志，2018（2）：65-68.

[7] 陈君红.油用牡丹籽化学成分分析及提取制备工艺研究[D].汉中：陕西理工大学，2018.

[8] 蒋磊.凤丹药材的品质评价及其栽培土壤中无机元素相关性研究[D].合肥：安徽中医药大学，2016.

[9] 张红玉.油牡丹籽提取物的分离纯化及抑菌活性研究[D].北京：中国林业科学研究院，2016.

[10] 韓晨静，孟庆华，陈雪梅，等.我国油用牡丹研究利用现状与产业发展对策[J].山东农业科学，2015，47（10）：125-132.

[11] 丁言.‘凤丹牡丹种子内源抑制物质的初步研究[D].长春：吉林农业大学，2015.

[12] 李静.牡丹籽油制备工艺及其稳定性研究[D].吉首：吉首大学，2014.

[13] 谭真真.芍药油用品种筛选及与油用牡丹‘凤丹对比研究[D].北京：中国林业科学研究院，2014.