胶质母细胞瘤中HOXD10基因启动子的甲基化检测及与预后的关系*

李明轩，方琪星，任虹宇，司昊天，马建功，王晓彬，张小广，方树民，何 承

河南大学第一附属医院 神经外科(开封 475000)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，包括胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)、星形细胞瘤、室管膜瘤等类型，其中GBM的恶性程度最高[1]。GBM以手术切除为主，辅助放、化疗等综合治疗。目前，GBM患者的生存率和生存质量依然较低[2]，探索治疗GBM的新思路或新方法一直是研究的难点和重点。DNA甲基化是最常见的表观遗传变化，可影响DNA与其他分子的相互作用，与基因沉默、细胞正常功能的维持、肿瘤的发生和发展等关系密切。研究[3]发现，DNA异常甲基化还可用于预测肿瘤复发、转移以及作为分子标记物评估肿瘤患者预后。同源盒(homeobox，HOX)基因是一类同源异性基因，除能够调控正常细胞发育、分化外，在组织细胞增殖和侵袭中也发挥关键调节作用[4]。HOX D10基因是HOX家族成员之一，其表达水平与结直肠癌、胃癌、胆管癌等多种恶性肿瘤的恶性程度关系密切，参与肿瘤的发生和发展过程[5-7]。目前，GBM中HOXD10基因启动子甲基化的状态研究还未有报道。本研究通过检测GBM患者HOXD10基因启动子的甲基化状态，分析其与患者预后的相关性，以期为GBM的预后评估提供一定的理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集河南大学第一附属医院2015年8月至2017年9月经确诊并行手术治疗的49例GBM标本，其中男25例，女24例，年龄26～81(58.63±8.49)岁。术前均未行放、化疗等治疗，患者临床资料完整，病理诊断明确。肿瘤组织按《WHO中枢神经系统肿瘤分类(2007)》病理分级，Ⅰ级10例，Ⅱ级9例，Ⅲ级13例，Ⅳ级17例。另选取30例正常脑组织标本(脑外伤组织、内减压脑组织等)作为对照，其中男15例，女15例，年龄28～80(60.27±9.51)岁。两组在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经河南大学第一附属医院伦理委员会批准同意。受试者知情并自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂和实验仪器

DNeasy Tissue Kit试剂盒，美国Sigma公司；DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；CpGenome TM DNA Modification Kit试剂盒，美国Merck Millipore公司；Wizard Clean up DNA纯化试剂盒，美国Promega公司；HOXD10基因启动子甲基化PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鼠抗人HOXD10单克隆抗体，英国Abcam公司；生物素标记的羊抗鼠IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司。超微量分光光度计，美谷分子仪器(上海)有限公司；显微镜，日本Nikon公司。

1.3 特异性PCR检测HOXD10基因启动子甲基化

取组织标本，按照D Neasy Tissue Kit试剂盒操作说明提取DNA。超微量分光光度计检测提取的DNA纯度和浓度。DNA样本在260 nm和280 nm处的吸光度的比值>1.8时可用于后续实验。然后按照CpGenomeTMDNA Modification Kit试剂盒操作说明对提取的DNA 进行修饰。DNA修饰后对其进行纯化，具体操作参照Wizard Clean up DNA纯化试剂盒操作说明。纯化后的DNA重悬于超纯水中，-20 ℃保存备用。采用PCR技术对纯化后的DNA进行扩增。HOXD10甲基化上游引物5'-TTATTTATGGGGATTCGGGTTC-3'，下游引物5'-AAAAAAACCGAATCCAAAAC AAACG-3'；非甲基化上游引物5'-ATTTAT TTATGGGG-ATTTGGGTTT-3'，非甲基化下游引物5'-AAAAAAACCAAATCCAAACAAACA-3'。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，经40个循环后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于凝胶成像系统观察结果。以无菌超纯水代替DNA作为空白对照。甲基化结果判断：M有特异产物，而U无产物，为完全甲基化阳性；M和U两者都有特异产物，为部分甲基化阳性；如果U有特异产物，而M无产物，为甲基化阴性。完全甲基化阳性和部分甲基化阳性均记为甲基化阳性。

1.4 免疫组织化学法检测HOXD10蛋白表达

组织标本经常规脱蜡处理、梯度乙醇水化、抗原修复后，置于pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液中，微波加热至沸腾，冷却，PBS清洗。封闭10 min，滴加HOXD10抗体(稀释比1∶800)，4 ℃孵育12 h。PBS代替HOXD10抗体作用阴性对照。孵育后洗涤，滴加生物素标记的IgG抗体(稀释比1∶100)，4 ℃孵育20 min。之后再滴加辣根酶标记链酶卵白素，4 ℃孵育20 min。孵育后PBS洗涤，滴加DAB显色液，染色5 min。经冲洗、苏木精复染、脱水、封片后显微镜下观察。HOXD10蛋白表达阳性细胞呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞核。从每张切片中随机挑选5个高倍视野，统计阳性染色细胞数量。1)按阳性细胞占百分比计分，<5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>76%记为4分；2)按染色强度计分为，无色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。取上述两项结果的乘积：≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。

1.5 随访

对患者进行随访，时间1年，记录患者手术之日起至肿瘤复发、转移或死亡时间。末次随访时间截至2018年9月。无进展生存期(progression free survival，PFS)即患者手术之日起至肿瘤复发、转移或残留肿瘤复发生长为止。总生存期(overall survival，OS)，即手术之日起至患者死亡为止。对于无复发、转移或死亡的患者，PFS和OS以末次随访时间计算。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组HOXD10启动子甲基化状态比较

GBM和正常脑组织HOXD10启动子甲基化阳性率分别为65.31%(32/49)、23.33%(7/30)。与正常脑组织相比，GBM中HOXD10启动子甲基化阳性率升高(P<0.05)(图1)。

图1 GBM中HOXD10启动子甲基化状态

2.2 HOXD10启动子甲基化状态与患者临床病理特征关系

HOXD10启动子甲基化状态与患者性别、年龄、Karnofsky功能状态评分标准(KPS评分)无关(P>0.05)。肿瘤直径>5 cm患者的HOXD10启动子甲基化阳性率高于肿瘤直径≤5 cm患者(P<0.05)，病理分级为高级别(Ⅲ～Ⅳ级)患者HOXD10启动子甲基化阳性率高于病理分级为低级别患者(P<0.05)(表1)。

表1 HOXD10启动子甲基化状态与患者临床病理特征关系

2.3 HOXD10启动子甲基化状态与患者预后关系

Kaplan-Meier法分析HOXD10启动子甲基化状态与GBM患者预后(PFS、OS)的关系。结果显示，GBM中HOXD10启动子甲基化阳性患者PFS(21.88%)、OS(9.38%)均低于阴性患者PFS(70.59%)、OS(47.06%)(P<0.05)(图2)。

图2 HOXD10启动子甲基化状态与患者预后关系注：A：PFS曲线；B：OS曲线

2.4 Cox比例风险模型分析影响患者预后因素

病理分级和HOXD10基因启动子甲基化状态是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表2)。

表2 Cox分析影响患者预后因素

2.5 HOXD10蛋白表达比较

免疫组化染色结果显示，正常脑组织和GBM中HOXD10蛋白阳性率分别为76.67%(23/30)、36.73%(18/49)，两者差异有统计学意义(P<0.05)。GBM中HOXD10基因启动子甲基化阳性患者HOXD10蛋白阳性率为12.50%(4/32)，甲基化阴性患者HOXD10蛋白阳性率82.35%(14/17)，两者差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示，GBM中HOXD10基因启动子甲基化与其蛋白表达呈负相关(r=-0.731，P<0.05)(图3)。

图3 HOXD10蛋白在GBM中表达(×200)

注：A：GBM中HOXD10蛋白阳性；B：GBM中HOXD10蛋白阴性

3 讨论

胶质瘤约占颅内原发性恶性肿瘤的70%，是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤。GBM患者人数在胶质瘤中占比约50%，危害性极强，严重威胁患者生命健康[8]。随着医疗水平的不断提高，胶质瘤的治疗手段有了很大的改善，但目前患者的中位生存期依然较短[9]，预后不佳，对该疾病病因及预后影响因素的探索具有重要意义。

HOXD10基因位于2号染色体p31位点，可调控细胞生长、发育，抑制细胞外基质重塑和迁移相关基因的表达，在多种肿瘤中表达异常。Sekar等[10]研究发现，乳腺癌组织中 HOXD10基因表达下调，与肿瘤组织学分级相关，肿瘤等级越高，其表达水平越低，提示HOXD10基因在乳腺癌中发挥重要的肿瘤抑制作用，其丧失会促进导致乳腺癌的发展。李民等[11]研究发现，人脑胶质瘤中HOXD10 mRNA和蛋白均较正常脑组织表达降低，与胶质瘤恶性程度呈负相关。本研究结果显示，胶质母细胞瘤中HOXD10 mRNA和蛋白较正常脑组织降低，与相关报道结果一致。而头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中HOXD10表达水平升高，HOXD10敲低可抑制HNSCC细胞中增殖和侵袭减少，可作为HNSCC预后评估的参考指标，这可能与肿瘤细胞类型不同有关。

DNA甲基化在调节机体生物学过程中发挥重要作用。DNA甲基化可抑制基因转录，造成基因沉默[12]。DNA甲基化造成的抑癌基因活性丧失也是肿瘤发生、发展的重要作用机制之一[13]。研究发现，HOXD10基因启动子在多种肿瘤中甲基化状态异常。杨海霞等[14]研究发现，胆管癌组织中HOXD 10基因启动子甲基化率较癌旁组织明显升高，且癌组织中HOXD10基因启动子甲基化与HOXD10蛋白表达呈负相关，HOXD10基因启动子区存在CpG位点甲基化个数≥7时可用作胆管癌患者预后不良的参考指标。Lin等[15]研究发现，胃癌患者血液中HOXD10甲基化率明显增加，且HOXD10甲基化与幽门螺杆菌状态，血清CA19-9和CEA水平及肿瘤浸润深度有关，HOXD10启动子高甲基化可能是胃癌早期诊断和病情监测的生物标记物。但是GBM中HOXD10基因启动子是否甲基化尚未有报道。本研究结果显示，GBM中HOXD10基因启动子甲基化阳性率高于正常脑组织，且患者病理分级越高，肿瘤直径越大，HOXD10基因启动子甲基化阳性率越高，提示HOXD10基因启动子甲基化参与GBM的发生、发展，与该疾病恶性程度密切相关。HOXD10基因启动子甲基化阳性患者PFS和OS低于阴性表达患者，是影响GBM患者预后的独立危险因素，提示患者HOXD10基因启动子甲基化阳性与患者预后不良相关，可作为患者预后评估的重要生物分子指标。同时，HOXD10基因启动子甲基化趋势与免疫组织化学法检测的HOXD10蛋白表达相反，相关性分析结果显示二者表达呈明显负相关，说明HOXD10基因启动子甲基化造成其蛋白表达沉默。

综上所述，GBM中HOXD10基因启动子甲基化阳性率上调，其阳性表达患者PFS和OS低于阴性表达患者，检测HOXD10基因启动子甲基化状态有助于评估患者预后。