红壤中不同AM真菌侵染的柑橘中多胺含量的比较①

陈美标 李 娟 陈杰忠 朱红惠 姚 青1,③

(1广东省微生物研究所/广东省菌种保藏与应用重点实验室/省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东广州 510070；2仲恺农业工程学院园艺园林学院 广东广州 510225；3华南农业大学园艺学院/广东省荔枝工程研究中心/广东省微生物信号与病害防治重点实验室广东广州 510642)

植物激素多胺(PAs)是小分子含氮化合物，有2个或2个以上含胺基团。在植物组织中，腐胺(PUT)、亚精胺(SPD)和精胺(SPM)是主要的多胺类型，且大多以游离态形式存在。植物组织中的多胺具有强烈的生物活性，参与了花芽分化、胚形成、器官发生、衰老、果实发育与成熟等生理过程[1]；更为重要的是多胺能够调控植物对生物和非生物胁迫的响应[2]，在作物的抗逆栽培中展现出很好的应用前景。在果树栽培中，多胺的研究和应用得到了广泛的重视，研究内容涉及侧根发生和根系生长等根系生理过程、花芽分化与授粉受精等生殖生理过程、幼果细胞分裂与果实成熟等果实发育生理过程[3]。在抗逆栽培方面，在干旱胁迫下施用外源Spd显著提高杏幼苗叶片的光合作用，增强其抗性[4]；在盐胁迫下施用3种外源多胺均可提高冬枣的光合速率，其中PUT和SPD的效应较强[5]；在盐碱胁迫下，施用外源3种外源多胺减轻了苹果幼苗叶片的失绿症状，其中PUT的效应较强[6]。这些研究表明，多胺不仅参与了果树的许多生理过程，而且施用外源多胺能够有效地提高果树对逆境环境的适应性。

柑橘是中国华南红壤区具有重要经济价值的栽培果树树种之一，然而该区域的柑橘栽培面临诸多逆境条件，对柑橘的可持续生产形成挑战。尽管华南降水充沛，但是存在明显的季节性分布不均[7]，全年高达70%的降水发生在4～9月，而10月至次年3月存在干旱问题[8]；高温持续时间长、极端温度高，经常发生日灼现象，对果面造成损伤[9]；湿热环境条件下病害频发，增加柑橘园管理的难度和成本；红壤盐基离子含量低，养分不足，严重制约管理水平低的果园的产量和品质。因此，多胺在华南红壤区的柑橘抗逆栽培中可能具有很好的应用前景。比如，杨枫等[10]的研究指出，施用0.4 mmol/L的外源SPD能够显著提高甜橙对溃疡病的抗性；Khoshbakht等[11]发现，叶片喷施0.5 mmol/L的外源SPD减轻了柑橘的盐胁迫伤害，光合速率增强，植株生物量和枝梢长度显著增加；Xiong等[12]向柑橘的叶面和果面喷施0.5～1.5 mmol/L的外源SPD，能够显著降低果实的粗皮现象，并分析指出这与减轻氧化胁迫有关；Fu等[13]则证实了1 mmol/L的外源SPM能减轻高温和干旱对枳的伤害。这些试验结果表明，外源多胺确实能够提高柑橘对胁迫环境的适应性，从而推动华南柑橘产区的抗逆栽培发展。

由于对环境存在潜在的污染，外源化学物质在农业生产中的施用近年来受到广泛的挑战。因此，利用生物措施调控柑橘组织中的多胺水平是一个可行的策略。研究指出，丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌可以提高许多植株的多胺含量[14-15]。AM真菌是一类与绝大多数陆生植物根系共生的土壤真菌，能够促进植物对各种胁迫的抗性，如干旱[16]、高温[17]、病害[18]，提高根系对养分的吸收[19]；AM真菌也能够提高许多植物的内源多胺水平或者改变内源多胺的平衡，如小麦[15]、葡萄[20]；同样，接种AM真菌也显著提高了柑橘的多胺水平[21]。这为利用AM真菌调控柑橘的多胺水平，从而实现柑橘的康逆栽培提供了环境友好的生物学途径。

不同AM真菌对柑橘的生长促进效应并不相同，因此，该课题组推测不同AM真菌提高柑橘多胺水平的程度也可能存在差异。基于此，本课题组比较了4种AM真菌对柑橘幼苗的多胺水平的影响，为筛选最佳的AM真菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验以 ‘暗柳橙’(Citrus sinensisOsbeck‘Anliucheng’)为供试植物，以苏格兰斗管囊霉(Funneliformis caledonium，FC)、球状巨孢囊霉(Gigaspora margarita，GM)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae，FM)、变形球囊霉(Glomus versiforme，GV)4个AM真菌菌种为供试真菌，进行接种试验。 ‘暗柳橙’果实从市场购买，取种子后洗净待用；AM真菌菌种由广东省微生物研究所菌种保藏中心提供，经三叶草扩繁获得本试验所用的菌剂。

本试验为盆栽试验，塑料盆上径12 cm、下径10 cm、 高10 cm， 以灭菌(121℃，2 h 2次)的柑橘园红壤为供试土壤。 ‘暗柳橙’种子经10%的NaClO3表面消毒后在灭菌蛭石中萌芽、培养4周(光照培养箱，25℃)，然后选大小一致的苗子移栽到塑料盆中，每个根箱1株苗。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

试验设4个处理，分别为接种F.caledonium(FC)、接种G.margarita(GM)、接种F.mosseae(FM)、接种G.versiforme(GV)，每个处理设3次重复，接种处理按照20%的接种量将菌剂与土壤均匀混合。所有塑料盆置于自然光照的玻璃温室中，水分管理按照18%的含水量隔天进行称重浇水，每2周浇一次20 mL的Hoagland营养液(磷1/4强度)。 植株生长20周后取样测定。

1.2.2 取样与测定

取样后将植株用自来水洗净，地上部与根系分离后分别测定鲜重。部分细根剪成2～3 cm长的根段，根据文献进行曲利苯蓝染色，用光学显微镜(Olympus BX53)观察并对菌根侵染率进行量化[22]。

PAs的提取参照文献[23-24] 的方法进行：分别称取1g叶片或嫩根，在5 mL 5%(m/V)预冷的高氯酸中冰浴研磨成匀浆，冰浴提取2 h，4℃离心20 min(16 000 r/min)，收集上清液；沉淀再加2.5 mL 5%预冷的高氯酸进行提取，收集并合并上清液；取4mL上清液，加入4mL2mol/L NaOH，40L苯甲酰氯，震荡，30℃水浴30min，加入8 mL饱和NaCl，8 mL冷乙醚，震荡，4℃离心10 min(3000 r/min)，收集全部上层乙醚相，用氮气吹干，残留物立即加1 mL60%甲醇(色谱纯)溶解，用混匀器高速震荡10 s，有机滤头过虑后用于测定游离态多胺含量。下层用4 mL5%(m/V)高氯酸悬浮，转入离心管后用4mL12 mol/L HCl洗净剩余残渣，混合，震荡，于110℃烘箱连续水解24 h，4℃离心30 min(8 000 r/min)，取上清液6 mL于培养皿中，80℃烘箱干燥，用1 mL 5%(m/V)高氯酸溶解后转入离心管，加入1 mL 2 mol/L NaOH,苯甲酰氯10 L，震荡10 s后30℃水浴30 min，然后加入2 mL饱和NaCl，2 mL冷乙醚，震荡10 s，4℃离心10 min(3 000 r/min)，收集全部乙醚相，用氮气吹干，残留物立即加0.8 mL 60%甲醇(色谱纯)溶解，用混匀器高速震荡10 s，有机滤头过滤后用于测定结合态多胺含量。

PAs含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，测定方法参照文献[25] 的方法略加改进。高效液相色谱仪为Agilent 1100 series，紫外检测器为VWD G1314A，波长254 nm，色谱柱为Hypersil ODS反向柱(5 m，5.0 mm×250 mm)柱温35℃，流动相为甲醇∶乙腈∶水＝64∶2.5∶33.5，流速为0.6 mL/min。待测样品用1 mL 60%甲醇(V/V)溶解，用有机滤头过虑(有机系，孔径为0.45m)后上机测定。进样量为10 L，用外标法定量计算，单位为nmol/g FW。

1.2.3 数据处理

所有数据为3个重复的平均值，邓肯氏多重比较和聚类分析用统计软件SPSS 21v进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同AM真菌的侵染率及对植株生长的影响

显微观察证实，AM真菌侵染了所有植株的根系，根内主要的AM真菌结构是丛枝和内生菌丝，根系表面附着大量的外生菌丝(图1)。4个菌种对柑橘根系的侵染程度在34.3%～56.0%，菌种之间没有显著差异(图2)。比较接种4个菌种的植株的生物量可以发现，尽管地上部鲜重不存在显著差异，但是摩西斗管囊霉接种的植株根系鲜重最大，显著高于苏格兰斗管囊霉接种的植株根系鲜重(图2)，整个植株的鲜重与根系鲜重的趋势一致。此外，不同菌株对根冠比没有产生显著影响(图2)。

图1 AM真菌对柑橘根系的侵染

图2 不同AM真菌菌种对柑橘根系的侵染和对植株生长的影响

2.2 不同AM真菌对植株的游离态多胺含量的影响

从图3可以看到，叶片中检出PUT、SPD和SPM全部3种多胺的游离态，而根系中SPM的游离态仅在接种变形球囊霉的植株中检出；就PUT和SPD而言，根系中游离态多胺的含量高于叶片中游离态多胺的含量。叶片中游离态PUT和SPD在不同菌种间没有显著差异，但是接种球状巨孢囊霉的植株叶片中游离态SPM的含量显著高于接种其他3个菌种的植株；根系中游离态SPD在不同菌种间也没有显著差异，但是接种变形球囊霉的植株根系中游离态PUT的含量显著高于接种摩西斗管囊霉的植株。这些结果表明，接种不同AM真菌菌种对柑橘植株中游离态多胺的含量的影响存在显著差异。

多胺对植株抗逆性的影响不仅体现在含量上，更重要的是不同多胺之间的平衡。表1的数据表明，叶片中PUT/PAs和(SPD+SPM)/PUT在4个菌种间没有显著差异，但是根系中PUT/PAs在不同菌种间存在显著差异，接种变形球囊霉的植株根系中PUT/PAs显著高于接种球状巨孢囊霉和摩西斗管囊霉的植株，其中接种摩西斗管囊霉的植株根系中PUT/PAs最低(表1)。

图3 不同AM真菌菌种对柑橘叶片和根系中游离态多胺含量的影响

表1 4接种AM真菌对游离态多胺平衡的影响

2.3 AM真菌对植株的结合态多胺含量的影响

结合态PUT、SPD和SPM在所有样品中均有检出，总体而言，叶片中的含量高于根系中的含量；叶片和根系中SPD含量最高(图4)。接种球状巨孢囊霉的植株叶片中结合态PUT含量显著高于接种其他3个菌种的植株、接种球状巨孢囊霉的植株叶片中结合态SPD含量显著高于接种摩西斗管囊霉的植株，而接种摩西斗管囊霉的植株叶片中结合态SPM含量显著高于接种其他3个菌种的植株；根系中结合态多胺的含量在4个菌种间没有显著差异(图4)。

图4 不同AM真菌菌种对柑橘叶片和根系中结合态多胺含量的影响

2.4 不同AM真菌影响植株多胺代谢的聚类分析

为了探讨哪些菌种对柑橘植株的多胺代谢具有相似的影响，本课题组基于不同形态多胺的含量及其平衡等19个指标，对4种AM真菌菌种进行聚类。结果表明，摩西斗管囊霉单独聚成一类，而苏格兰斗管囊霉和变形球囊霉聚在一组，球状巨孢囊霉则与苏格兰斗管囊霉、变形球囊霉组更为接近(图5)。结合植株生物量的数据，接种摩西斗管囊霉的植株鲜重最高、接种苏格兰斗管囊霉的植株鲜重最低，推测AM真菌对多胺代谢的差异性影响是导致植株鲜重差异的原因之一。

图5 基于多胺含量指标的不同AM真菌菌种的聚类分析

3 讨论

AM真菌是华南果园土壤中常见的习居有益共生微生物，能够与许多热带亚热带果树建立共生关系[26]，AM真菌在柑橘的抗逆栽培中的重要性已经得到广泛证实[16-19]。尽管前人大量的研究表明，促进根系对养分的吸收是AM真菌提高柑橘抗逆性的重要机制，但是也有研究表明，AM真菌对柑橘植株的多胺代谢的调控也是增强抗逆性的机制之一[21,27]。在此基础上，本研究比较了4种AM真菌菌种对柑橘多胺代谢的影响，发现不同菌种之间存在显著差异，不仅体现在不同多胺组分的含量上，也体现在不同多胺组分的平衡上。

本研究发现，在供试的苏格兰斗管囊霉、球状巨孢囊霉、摩西斗管囊霉和变形球囊霉中，接种摩西斗管囊霉的植株的生物量最高；而在基于多胺含量的聚类分析中，摩西斗管囊霉也单独聚为一组，表明多胺可能与AM真菌对柑橘植株生物量的影响密切相关。进一步的细致分析可以发现，接种摩西斗管囊霉的植株的叶片和根系中PUT/PAs最低，而(SPD＋SPM)/PUT最高，表明多胺的平衡可能在AM真菌调控柑橘植株生长上比多胺的含量更为重要。PUT/PAs和(SPD＋SPM)/PUT这2个指标是衡量多胺增强植株抗逆性的常用指标[28-30]。Li等[28]发现，生姜受到的低温胁迫越强，则PUT/PAs值越高；贾永霞等[29]认为，外源SPD可以通过降低PUT/PAs、增加(SPD＋SPM)/PUT来提高黄瓜幼苗对低氧胁迫的抗性；刘建新等[30]发现，较低的PUT/PAs和较高的(SPD＋SPM)/PUT与燕麦的盐碱胁迫强度正相关。本研究中没有对柑橘植株施加胁迫处理，但是自然光照的温室条件下，轻微的高温、干旱等胁迫很可能可能是客观存在的。这表明，接种不同AM真菌菌种的生物量存在差异，部分的原因是它们对柑橘的多胺代谢，尤其是多胺的平衡，产生了不同的影响。

施用外源多胺可以增强植株的抗逆性。本研究证实了接种AM真菌可以替代外源多胺的施用，调控柑橘植株的多胺代谢水平，且存在菌种的差异。但是，存在2个问题需要将来加以研究：一是不同AM真菌菌种引起的这种多胺代谢的差异是否真的导致其抗性的差异？需要通过施加不同胁迫处理的试验加以证实；二是本研究只是比较了4个菌种之间的差异，因为此没有设置不接种对照，如果要探讨接种AM真菌是否真的可以替代外源多胺，需要设置不接种AM真菌但是施用外源多胺的处理进行比较。Wu等[21]比较了接种和未接种摩西斗管囊霉(FM)的柑橘植株多胺代谢差异，指出AM真菌通过调控参与多胺代谢的酶活性(如精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、二胺氧化酶、多胺氧化酶)来改变柑橘植株的内源多胺含量。

总体而言，本研究揭示了不同AM真菌菌种对柑橘的多胺代谢的影响模式是不同的，这种差异可能与其生长促进效应有一定的关系；与多胺的含量相比，多胺的平衡可能是AM真菌影响柑橘生物量的更重要的原因；在供试的4个菌种中，摩西斗管囊霉对多胺的调控模式更有利于促进柑橘植株生长。本研究结果为在华南红壤中应用AM真菌开展柑橘的抗逆栽培以及开展菌种优选的必要性提供一定的依据。