深低温冷冻保存血小板最佳时限的研究

付凌梅，杨振宇，刘媛媛

（云南昆明血液中心 质保科，云南 昆明 650106）

在恶性血液病患者治疗中，外周血干细胞移植是最有效的方法之一，但在移植手术中由于各种原因会引起血小板等血细胞急剧减少，故在移植手术后，为了更好地控制出血，需多次输入单采血小板，以防止患者大出血[1]。因此，保证足量的血小板供应就显得尤为重要。单采血小板因在保存过程中容易丧失活性等原因，目前主要采取的方法是在常温振荡条件下保存5d[2]。过期的血小板由于功能丧失，感染细菌的可能大大增加一般被扔弃。怎样增加血小板存活率及延长其保存期，减少血小板活化，已成为当下研究的热点。

由于血小板的保存损伤机制十分复杂，涉及到血小板代谢的改变、活化机制等很多个方面，故冰冻保存血小板的研究工作目前尚未有突破性进展[3]，以致没能被广泛应用。低温保存主要在于减低生物细胞中的酶活性，从而使细胞的代谢处于基本停止状态[4,5]。目前还是以5%～6%DMSO作为深低温冷冻保护剂将血小板冰冻保存在-80℃这一方法为主，因此方法能使血小板长期保存较稳定[6]。

当下，国家还未制定冰冻血小板的质量标准及储存期限，徐学新等[7]认为冰冻血小板保存期可达6～12月，解冻后血小板的聚集功能恢复良好。输入冰冻保存血小板后虽然血小板计数增加不如新鲜机采血小板明显，但出血症状改善明显，止血效果优于新鲜机采血小板[8]。当下研究表明，深低温冰冻单采血小板对保存血小板具有很好的效果[9]。尽管冰冻保存后的血小板在数量和形态上变化不大，保存完好，但是血小板发生了明显的活化（冰冻后血小板表面的CD62显著升高）。与22℃条件相比，－80℃条件下冷冻血小板生物活性物质衰减的速度显著减慢，衰减速度可能接近零。所以，冷冻保存血小板的优势还可能在于它能更好维持血小板胞内生物活性物质，如血小板因子、凝血因子和促凝血物质的有效活性，从而维持并提高了血小板的止血凝血功能[10]。

在欧洲对冰冻保存血小板质量控制标准中有严格规定：冻融后的血小板计数只要＞冻前数量的40%即视为合格[11]。本研究就是通过制备冰冻血小板，选择在-80℃深低温冰箱中进行保存，在保存到6月、12月时复融对血小板各项质量指标进行检测，找到深低温保存血小板的最佳储存期限，指导临床使用并期望通过对血小板冻存技术的改进，在器官移植（尤其是干细胞移植）、危急重症疾病、特殊血型、大剂量化疗等相关治疗新技术的应用中，发挥其不可替代的作用。

资料与方法

一、试剂、仪器与主要设备 二甲基亚砜原液、注射用0.9%生理盐水、FC500流式细胞仪配套校准、测定试剂、FC500流式细胞仪、KX-21血细胞分析仪、5mL一次性使用无菌注射器、-80℃冰箱、空气孵育振荡器TITRAMAX1000、XHZ-IB型血小板恒温振荡保存箱、KJX-IA冰冻血浆解冻箱、SW-CT净化工作台。

二、样本来源 从符合国家GB18467-2011《献血者健康检查要求》的献血者中随机选取16例（n=16），年龄为18～55周岁。用Trima全自动血细胞分离机及耗材进行采集。要求：红细胞比积为0.35～0.55、血小板计数＞2.5×1011/L；在献血前1d内未吃高脂食品、未饮含酒精类饮料；2周内没有服用过阿司匹林及其它影响血小板功能的任何相关药物；未检测到出凝血性疾病。当日不空腹，上肢静脉充盈良好，捐献机采血小板间隔时间≥1月，近6月内未献过全血；血小板收集量为80～100mL。血液采集时间正常，穿刺顺利，采集过程中未有血流不畅等情况。

三、冰冻血小板的制备 将采集的机采血小板在血小板恒温振荡保存箱内振荡2～4h，在检查血小板已解聚、无异常后，在百级净化台内用一次性使用无菌注射器准确抽取所需DMSO的量，消毒血小板袋顶端的留样管，穿刺入消毒好的留样管内，针尖伸入袋内1～2cm。血小板袋置于振荡器上，以1mL/min缓慢、匀速地推入。加入DMSO的过程须缓慢、均匀，并轻柔顺时针晃动血小板。推药结束、拔出针头、排出袋内空气、热合封口、检查血小板袋有无被针尖刺破，袋身有无被DMSO烧灼变白，再次检查有无血小板聚集、蛋白析出。加药前，尽量排尽袋内空气，加药时的振荡会使残余的空气形成大量气泡。将每个加好5%DMSO的血小板分装到冷冻管中，每管5～8mL；放入-80℃低温冰箱中冰冻保存。

四、检测 冰冻保存6月、12月后，分别将保存在-80℃低温冰箱中的16个标本复融后立即进行6项指标（血小板计数、平均血小板体积、血小板分布宽度、CD42b、CD61、CD62P）的检测。

五、统计方法 所有数据经质控后采用SPSS 19.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、-80℃时冰冻保存后6月的血小板与新鲜血小板各项指标检测结果

将血小板冰冻保存在-80℃后6月的4个指标（血小板回收率，MPV增加值，CD42b，CD62p）与血小板冰冻前的指标进行比较：冰冻保存6月的血小板与冰冻前血小板相比，CD42b无统计学意义，而CD62p与冰冻前血小板相比则差异有统计学意义 （P＜0.05），见表1。

二、-80℃时冰冻保存后12月的血小板与新鲜血小板各项指标检测结果

将血小板冰冻保存在-80℃后12月的4个指标（血小板回收率，MPV增加值，CD42b，CD62p）与血小板冰冻前的指标进行比较：冰冻保存12月的血小板的CD42b、CD62p与冰冻前血小板相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

讨 论

血小板输注是临床救治出血及各种原因所致的血小板减少的重要手段。但目前血小板从新鲜血液中采集后仅能在（22±2）℃振荡条件下保存5d时间，且使用前需要提前预约，因此无法保障临床急诊患者的需求，特别是偏远地区。这在很大程度上制约了临床出血患者的紧急抢救，因此新鲜血小板的保存方法一直是国内外输血界关注的问题[12]。

表1 冰冻保存6月与冰冻前的检测结果

表2 冰冻保存12月与冰冻前的检测结果

在低温条件下，生物细胞的代谢速度减慢，在-80℃以下冰箱内或-196℃液氮中，细胞代谢趋于停滞，可以长期保存。虽然程序降温，超低温（-196℃）液氮冻存细胞是维持细胞生物活性、功能的最理想方法，但由于设备要求高，技术难度大，设备条件需长期更换液氮，可能因偶然因素彻底损坏细胞等不利因素，不太适用于存量较大的血小板冻存。因此避开程序降温液氮保存，-80℃深低温冰箱冻存是维持生物细胞、组织活性、保留新鲜血小板生理功能较理想的方法之一。

冷冻保存血小板的止血功能明显＞22℃保存的血小板，可能与冷冻保存后血小板膜表面新的亚群的产生有关。CD62p（血小板激活的重要标志）的再表达表明，血小板通过低温保存后产生了新亚群，新亚群膜表面功能分子的变化与其体内存活率减低而即刻止血功能增强密切相关[13]。冷冻保存后血小板膜CD62p表达水平明显升高，说明在保存过程中存在血小板的激活现象。其激活的机制除与内皮抑制功能消失有关外，还可能与血小板悬浮液中促凝物质的增加有关。有研究显示[14]，血小板悬浮液中的补体成分、凝血酶和纤溶酶都能导致血小板的活化。

本次实验表明，冻存6月之内的机采血小板其各项功能指标均符合质量要求，没有发生显著变化；而冻存时间半年以上的冰冻血小板其各项功能指标发生明显下降。因此，建议冰冻血小板的冻存时间以半年为佳。5%DMSO-80℃冰冻保存半年以内的机采血小板具有良好的止血功能，其在临床中的应用得到了肯定。

虽然冰冻血小板输注后，患者血小板增加值及体内回收率较低，但是冰冻血小板保存时间较长，特别适合急、危重患者及节假日期间出血患者的输注，能让出血患者及时度过生命危险期，方便临床[15]。由于捐献血小板的献血者紧急情况下不易找到，机采血小板采集时间又长，如临床急需时无法及时得到供应，故冰冻血小板的制备无疑确保了临床急用血小板的需求[16]。

保存期内，血小板的活性与冰冻前差异无统计学意义，其超微结构虽然有了一定程度的改变，产生了新的亚群，但即刻止血功能效果良好。尽管需要进一步完善制备、保存和融解技术，但冰冻后血小板的功能无明显变化，长期保存后质量稳定[17]，融化方法简单、供应及时，将成为临床急诊患者的最佳选择。

综上所述，冰冻保存血小板的研究工作虽然已经开展了20多年，但至今尚未有突破性进展[18]，其最佳制备、最佳保存温度、最佳保存期限等等一系列问题还在探讨和优化中。深低温冻存血小板的研究有着非常广阔的前景，其对临床输血的重要性也是不言而喻的，我们期望通过本研究可以探明深低温冰箱冻存血小板的理论基础，对血小板冻存技术的改进，取得方法上的突破。冰冻保存血小板在当下看来有可能是新鲜血小板替代物的最佳侯选者，假如能够替代成功，那么其意义将是深远和巨大的。