间歇性酒精暴露对青少年期小鼠酒精犒赏及焦虑行为的影响☆

黄慧 张晓洁 傅潇雅 郝伟 向小军

狂饮在青少年人群中较为常见[1]。研究发现间歇性酒精暴露（adolescent intermittent ethanol exposure，AIE）能较好地模拟青少年狂饮，经过AIE处理的大鼠，酒精消耗量增加，焦虑水平升高[2-3]。然而研究结果并不一致，部分研究报道AIE虽然能增强大鼠对酒精的犒赏效应，但降低焦虑水平[4-5]。C57BL/6小鼠对酒精存在天然偏好，较容易形成稳定的酒精条件性位置偏爱 （conditioned place preference，CPP）[6]，也是焦虑行为相关研究中频繁用到的动物[7]。目前AIE研究多以大鼠为实验对象，缺乏小鼠的研究，AIE对小鼠酒精犒赏效应及焦虑行为的作用尚不明确。故本研究拟在青少年期C57BL/6小鼠中通过AIE建立狂饮模型，利用酒精CPP评价酒精犒赏效应，使用高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）实验测试其焦虑水平，以探讨青少年狂饮对酒精犒赏及焦虑行为的影响，以期为青少年狂饮的早期干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物100只SPF级4周龄健康雄性C57BL/6小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠适应性饲养1周，动物饲养间内温度（23±1）℃，湿度 55%±5%，小鼠自由进食及饮水。

1.2 实验流程本研究由两部分实验构成。实验1，将20只小鼠随机分成AIE组及NS组，每组10只，一组接受AIE处理，一组接受生理盐水处理；24 h后2组小鼠均行酒精的CPP实验。实验2，另取80只小鼠经EPM测试后，分为高、低焦虑组（20只/组），中间水平焦虑小鼠淘汰；高、低焦虑组中再分别随机分为AIE组、NS组 （10只/组），分别接受AIE处理或生理盐水处理；24 h后，4组小鼠再次行EPM测试。在实验2中，高焦虑NS组及低焦虑NS组各死亡2只小鼠，故最终只有8只小鼠的数据纳入分析。

1.3 实验方法

1.3.1 AIE方法 利用AIE模拟青少年狂饮。AIE方法参照VETRENO等[8]的研究：小鼠腹腔注射25%酒精（3 g/kg），连续给药 2 d 后，停止 2 d，后继续给药2 d，再停止2 d，即在小鼠出生后36 d、37 d、40 d、41 d、44 d、45 d、48 d、49 d 时腹腔注射酒精，一共给药8次，总耗时16 d。生理盐水处理即按照上述流程给予小鼠等体积生理盐水腹腔注射。

1.3.2 CPP实验 利用CPP实验评价酒精的犒赏效应。CPP装置及分析系统购自上海吉量软件科技有限公司。该装置由4个CPP箱组成，4只小鼠可同时进行CPP实验。每个CPP箱由两侧箱体及中间箱构成，左侧箱体为黑白横条纹及网格底板，右侧箱体为黑白竖条纹及横杠底板。中间箱较狭窄，与两侧箱体之间有活动挡板隔断，可根据实验需要开启或关闭。装置自带红外传感器，能自动记录小鼠的活动情况，并将数据传输至分析系统。实验方法参照VALLOF等[9]的研究。第1天进行预适应，将中间箱挡板取出，小鼠从中间箱放入，小鼠在CPP装置中自由活动30 min。第2天进行预测试，将中间箱挡板取出，小鼠从中间箱放入，小鼠在CPP装置中自由活动15 min，记录其在两侧箱体中停留的时间，选择停留时间较短一侧箱体作为小鼠CPP训练的伴药侧，即CPP训练时给予酒精后小鼠放入的一侧，记录预测试伴药侧停留时间。训练（第3～10天）：将中间箱挡板放入，左右两侧箱体与中间箱隔断，第3、5、7、9天上午8点，小鼠分批次腹腔注射20%酒精（2 g/kg，12.5 mL/kg）后随即放入伴药侧活动 50 min；第 4、6、8、10 天上午8点，小鼠分批次腹腔注射等体积生理盐水（12.5 mL/kg）后随即放入非伴药侧活动50 min。测试（第11天）：末次训练24 h后，将中间箱挡板取出，小鼠从中间箱放入，小鼠在CPP装置中自由活动15 min，记录小鼠在伴药侧停留的时间。CPP值（单位：s）为测试时伴药侧停留时间与预测试时伴药侧停留时间之差。若测试伴药侧停留时间比预测试伴药侧停留时间显著延长，差异有统计学意义，则说明小鼠形成酒精CPP。

1.3.3 EPM实验及分组 利用EPM实验评估小鼠的焦虑行为。实验流程参照吴冰洁等[10]的研究，上午8点小鼠转运到行为学实验室专用临时笼架，适应环境30 min；之后，小鼠面朝EPM开放臂，放置于开放臂与闭合臂接合处，自由活动5 min。记录开放臂及闭合臂停留时间，计算开放臂时间比（the percentage of time spent in the open arms，OT%），OT%=开放臂时间/（开放臂时间+闭合臂时间）×100%。高、低焦虑小鼠分组标注参照HUANG等[11]的研究：根据 OT%的第 25百分位数（P25）及第75百分位数（P75）将小鼠分为低焦虑组（OT%≥P75）和高焦虑组（OT%≤P25），其余小鼠（P25＜OT%＜P75）均被淘汰。

1.4 统计学方法用SPSS 20.0进行统计分析。实验1中，测试伴药侧停留时间与预测试伴药侧停留时间的比较采用配对t检验，CPP值组间比较采用独立样本t检验。实验2分别在高、低焦虑组中，前后两次开放臂时间比在AIE组和NS组间比较采用重复测量方差分析。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 实验1小鼠酒精CPP值实验1中，AIE组小鼠测试和预测试伴药侧停留时间分别为（401.6±20.9）s和（285.5±14.3）s，前者较后者延长（t=4.502，P=0.001）；NS组小鼠测试和预测试伴药侧停留时间分别为（352.0±12.6）s 和（281.2±14.1）s，前者较后者延长（t=2.504，P=0.041）。AIE 组和 NS组 CPP值分别为（116.1±12.9）s 和（70.8±14.8）s，AIE 组CPP 值比 NS 组更高（t=2.274，P=0.035）。

2.2 实验2小鼠处理前后开放臂时间比实验2中OT%经重复测量方差分析，对于高焦虑小鼠，时间主效应 （F=1.952，P=0.181）、AIE分组主效应（F=0.250，P=0.624）及二者的交互作用（F=0.098，P=0.759）均无统计学意义。对于低焦虑小鼠，时间主效应有统计学意义（F=12.199，P=0.003），AIE 分组主效应（F=1.910，P=0.186）及二者的交互作用（F=1.648，P=0.218）无统计学意义。 见表 1。

表1 高、低焦虑小鼠在AIE或NS处理前后EPM实验开放臂时间比（OT%）

3 讨论

本研究发现，与NS组相比，AIE组CPP值更高，提示AIE促进青少年期小鼠酒精CPP的形成，青少年狂饮可能会增加酒精使用障碍的患病风险。该结果与既往在大鼠研究中的结果相一致[2-3，12-13]，说明狂饮对酒精犒赏效应的促进作用可能与动物品系无关。既往研究进一步发现，AIE能诱导青少年大鼠杏仁核区组蛋白甲基化[2]或乙酰化[10]，或前额叶组蛋白乙酰化[3]，进而导致其酒精消耗量增加。说明青少年期大鼠狂饮可能会导致某些脑区组蛋白修饰发生改变，进而增加酒精觅药行为及饮酒量，促进酒精使用障碍的发生和发展，但其中的分子生物学机制仍需深入探索。

本研究还发现，AIE处理不改变高、低焦虑小鼠的焦虑水平，提示AIE对小鼠酒精CPP的促进作用与焦虑无关。该结果与既往以Wistar大鼠或SD大鼠为实验对象的研究结果相一致[14-15]。MARCO等[15]报道，青少年期Wistar大鼠经AIE处理后使用EPM测量其焦虑水平，发现其与对照组无差异，该结果在CIPPITELLI等[14]研究中得到验证。另外，PANDE等[12]发现，给予青少年期SD大鼠AIE处理后进行黑白箱实验及EPM测试，也发现其焦虑水平不变。本研究在AIE处理后24 h再次测量小鼠的焦虑水平，即停止酒精摄入后24 h，小鼠处于酒精戒断期，而青少年期小鼠对酒精戒断所致焦虑不敏感[16]，故焦虑水平不发生明显改变。另一个可能原因是，本研究的酒精剂量不足以使小鼠在停止饮酒24 h后出现戒断症状，因此不会出现焦虑水平升高，在今后的研究中，需要设置不同剂量酒精来加以证实。此外，AIE实验中酒精给药方式可能也会影响动物的焦虑水平：本研究酒精的给药方式为腹腔注射，小鼠焦虑水平不变；有研究通过口服给予酒精，结果发现AIE会升高焦虑水平[17]；而通过吸入给予酒精，结果则显示AIE降低焦虑水平[18]。

本研究初步明确AIE增强小鼠对酒精的犒赏效应，同时不改变小鼠的焦虑水平，提示临床中应及早对青少年狂饮进行干预，为青少年狂饮的预防及早期干预提供了理论依据。本研究的不足主要在于缺乏相关分子生物学实验，未能探讨AIE增强酒精犒赏的分子机制，未来将会从组蛋白修饰等方面进一步开展研究。