Cu2+胁迫对大豆生长和抗氧化酶活性的影响

张亚坤 宋鹏 潘大宇

摘要：植物体摄入过量的重金属Cu2+会对植物产生毒害作用，为探讨外施Cu2+对大豆幼苗的毒害机理，以齐黄35为试验材料，采用盆栽法，以不同浓度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+处理液进行胁迫，研究外源Cu2+胁迫对大豆丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶POD）和根茎干鲜质量（地上干鲜质量和地下干鲜质量）的影响。结果表明，随着Cu2+胁迫浓度的增加，MDA含量呈现上升趋势;对2种抗氧化酶的活性影响显著，但活性影响方向不一致，显著降低SOD活性，增强POD活性，各Cu2+处理下SOD活性与同期对照组（15 d）相比降低 1.90%～19.55%，POD活性与同期对照组（15 d）相比增强31.36%～49.45%;Cu2+胁迫显著降低大豆幼苗地上干质量、地上鲜质量、地下干质量、地下鲜质量、总鲜质量、总干质量，与对照组相比，400 μg/g浓度的Cu2+胁迫分别下降了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。Cu2+胁迫引起丙二醛、抗氧化酶和根茎干鲜质量的显著变化，抑制大豆幼苗的正常生长，丙二醛是Cu2+胁迫的重要表征指标，研究为大豆幼苗的Cu2+毒害机理提供依据。

关键词：Cu2+胁迫;活性氧;抗氧化酶;生物量;大豆

中图分类号： S565.101  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0089-04

Cu2+是植物体生长必需的微量元素，参与植物体电子传递和光合作用，在植物的正常生长发育过程中起着重要的作用，但植物组织中过量的Cu2+会对植物产生毒害作用。有研究报道，受到Cu2+毒害的植物植株增长减少、光合作用减弱、矿物质元素摄入量下降[1-3]。

植物体摄入过量的重金属Cu2+会使植物活性氧（reactive oxygen species，简称ROS）的产生与清除失衡，导致植物体活性氧的积累进而抑制植物生长并对植物产生毒害作用。活性氧产生后，会使植物器官中的膜脂发生过氧化，产生过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，简称MDA）[4]。Liu等在玉米和水稻中研究发现，高浓度的Cu2+能够增加植物不同组织的丙二醛含量[5-6]。植物可通过增加抗氧化酶、在根中对重金属进行螯合等协调机制承受一定程度的Cu2+胁迫[7-8]。这些协调机制中，抗氧化防御系统在降低植物Cu2+毒害方面起着重要的作用[9-10]。抗氧化防御系统通过相关酶促和非酶促清除系统的启动，以减轻或消除活性氧积累对植物的伤害，酶促系统主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD）、过氧化氢酶（catalase，简称CAT）、过氧化物酶（peroxidase，简称POD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbata peroxidase，简称APX）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，简称GR），非酶促反应主要包括抗坏血酸（ascorbic acid，简称AsA）、类胡萝卜素（carotenoid，简称Car）以及一些含巯基的低分子化合物等[11-12]。Shashi等在鹰嘴豆和甘蓝型油菜中研究发现，Cu2+胁迫能够增加抗氧化酶活性[13-14]。Liu等在玉米中研究发现低浓度的Cu2+胁迫增加过氧化物酶活性，高浓度的Cu2+胁迫降低过氧化物酶活性[5]。

近年来，随着工业生产、矿井开采和城市活动使得农业水源和土壤中富集大量金属Cu2+，Cu2+胁迫已成为导致作物减产和品质下降的主要因素之一[15]。本研究通过测定不同浓度Cu2+处理下大豆幼苗丙二醛含量、酶活性和生物量的变化，探讨Cu2+对大豆幼苗生长和抗氧化酶的影响，以期为深入阐明植物耐Cu2+机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与生长环境

试验品种为齐黄35（审定编号：国审豆No.2015005），于2016年10—12月在国家农业智能装备工程技术研究中心小汤山国家精准农业示范基地（116.44°E，40.18°N）中进行盆栽培养。挑选颗粒饱满、大小均一的大豆种子，用1% NaClO溶液消毒15 min，之后用去离子水冲洗3次，用吸水滤纸吸干水分，挑选完好无损的大豆种子种于盆中，盆中预先用水浇透，每盆种植10粒种子，种子上覆盖3 cm厚的干土基质。花盆直径25 cm，高20 cm，每个花盆装入6 kg的土基质（土与育苗基质按比例混合）。盆土基质基础肥力为有机质含量为52.6%，全氮含量为1.47%，速效钾含量为 143 mg/kg，有效磷含量为13.1 mg/kg，pH值为5.5。20 d后挑选长势一致的幼苗，每盆留苗4株，共24盆96株。试验期间，温室内温度保持在15～25 ℃，相对湿度（RH）为60%～75%，日间光合有效辐射（PAR）为400～800 μmol/（m2·s）。

1.2 Cu2+胁迫处理

Cu2+胁迫参照GB 15618—1995《土壤环境质量标准》中3个等级标准值设置[16]。采用分析纯CuSO4·5H2O制备浓度为0、20、200、400 μg/g的Cu2+处理液备用。试验中设置4个Cu2+梯度（表1），每个梯度均设置6个平行试验，即4个处理6个重复24盆盆栽大豆幼苗。

以上处理分别在Cu2+胁迫后5、10、15 d，摘取大豆幼苗顶部第3～5叶位完全成熟的叶片，立即带回实验室进行MDA含量和抗氧化酶（SOD、POD）活性测定。在Cu2+胁迫处理15 d进行生物量的测定。

1.3 測定指标和数据分析

1.3.1 MDA含量和抗氧化酶活性测定 MDA含量测定采用赵世杰等改进方法[17]。SOD活性测定采用NBT法（nitrotetrazolium blue chloride，氯化硝基四氮唑蓝法）[18]，POD活性采用愈创木酚法[19]测定。指标测定时，每个处理6次重复，取平均值。

1.3.2 生物量测定 处理15 d后，不同处理下的大豆幼苗通过去离子水冲洗干净，并用吸水纸吸干附着于样品上的水分，用剪刀将大豆样品分为地上和地下部分。用分析天平分别称取大豆样品地上部分和根系的鲜质量（g/株），然后于105 ℃下杀青0.5 h，再在80 ℃烘干至恒质量，分别称取大豆样品地上部分和根系的干质量（g/株）。

1.4 数据统计

采用Origin软件制作图形，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），数据显著性差异运用Duncans新复极差法进行多重比较（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 Cu2+胁迫对大豆幼苗MDA含量的影响

MDA含量随时间的延长呈先升高后下降趋势。不同Cu2+胁迫处理下大豆幼苗叶片MDA含量差异显著，Cu2+胁迫能够显著增加大豆幼苗叶片MDA含量。由图1可知，处理5 d，Cu2+胁迫浓度在200 μg/g下，大豆幼苗MDA含量与CK相比增幅较小，差异不显著（P>0.05）;Cu2+胁迫浓度在 400 μg/g 下，大豆幼苗MDA含量显著升高，与CK相比增加了62.76%。处理10 d，各Cu2+胁迫处理下大豆幼苗MDA含量与CK相比差异均达到显著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g 下MDA含量与CK相比分别增加了20.6%、54.85%、62.76%，其中Cu2+胁迫浓度在400 μg/g下MDA含量达到最大值7.2 mmol/g。处理15 d，各Cu2+胁迫处理下大豆幼苗MDA含量与处理10 d相比有所下降，但与CK相比，各处理均达到显著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g下MDA含量与CK相比分别增加了23.36%、56.53%、61.43%。MDA含量随Cu2+胁迫浓度的增加而显著增加，表明外施Cu2+能诱导大豆幼苗MDA含量的升高，MDA含量高表明细胞膜脂过氧化程度增加，植物细胞膜受到的伤害增大。

2.2 Cu2+胁迫对大豆幼苗抗氧化酶活性的影响

2.2.1 对大豆幼苗SOD活性的影响 随着Cu2+胁迫浓度和时间的延长，Cu2+胁迫处理能够显著降低大豆叶片SOD活性（图2-A）。处理5 d后，Cu2+胁迫浓度在400 μg/g下SOD活性与CK相比差异达到显著水平（P>0.05），大豆幼苗SOD活性降低了19.07%，其他Cu2+胁迫浓度下SOD活性与CK相比差异不显著。处理10 d，Cu2+胁迫浓度在20 μg/g下SOD活性与CK相比差异不显著（P>0.05）;Cu2+胁迫浓度在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性与CK相比差异达到显著水平，与CK相比SOD活性分别降低了20.05%和 24.86%，其中Cu2+胁迫浓度400 μg/g下SOD活性最小，为116.96 U/g。处理15 d，各Cu2+胁迫浓度对大豆幼苗SOD活性的影响与处理10 d类似，Cu2+胁迫浓度在20 μg/g下SOD活性与CK相比降低了1.90%，但差异未达到显著水平（P>0.05）;在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性与CK相比分别降低了19.78%和19.55%。

2.2.2 对大豆幼苗POD活性的影响 随着Cu2+胁迫处理时间的延长，Cu2+胁迫处理能够显著增加大豆叶片POD活性（图2-B）。处理5 d，各Cu2+胁迫下大豆幼苗POD活性与CK相比差异不显著（P>0.05）。处理10 d，各Cu2+胁迫下大豆幼苗POD活性与CK相比差异均达到显著水平（P>0.05），Cu2+胁迫浓度在20、200、400 μg/g下SOD活性与CK

相比分别增加了25.61%、34.49%、42.4%。处理15 d，各Cu2+胁迫浓度对大豆幼苗POD活性的影响与CK相比差异均达到显著水平（P>0.05），分别增加了31.36%、33.94%和49.45%，其中Cu2+胁迫浓度在400 μg/g下POD活性达到最大，为266.81 U/g。

2.3 Cu2+胁迫对大豆幼苗生长和生物量的影响

2.3.1 对大豆幼苗生长的影响 Cu2+处理对大豆幼苗造成的毒害症状较明显，主要表现在茎秆和叶脉会呈现黄褐色毒害症状（图3）。随着Cu2+处理时间的延长毒害症状从植物形态学下端向上端蔓延，对叶片的毒害是从叶片与叶柄连接处开始向整个叶的主脉和侧脉延伸扩展。Cu2+处理后10 d，CK与20 μg/g Cu2+胁迫浓度下大豆幼苗生长状况类似;200 μg/g Cu2+胁迫浓度下大豆幼苗基部茎秆呈现黄褐色病斑，部分植株中部叶片由叶柄向主叶脉蔓延黄褐色病斑;400 μg/g Cu2+胁迫浓度下严重影响大豆生长，与对照组相比，茎秆纤细、植株矮小，Cu2+毒害蔓延至新生叶片，黄褐色病斑从主叶脉蔓延到侧脉，严重的会覆盖整个大豆叶片，大豆植株基部叶片严重畸形、萎蔫。

2.3.2 对大豆幼苗生物量的影响 由表2可知，Cu2+胁迫处理显著抑制大豆幼苗的生长。Cu2+胁迫浓度在20 μg/g时，主要抑制大豆幼苗地上部分的生长，对幼苗地下鲜质量和总鲜质量的影响不显著（P>0.05），与CK相比，对地上鲜质量、地上干质量、根干质量和总干质量影响显著，分别减少了21.49%、32.39%、33.33%、33.61%。而Cu2+胁迫浓度在200 μg/g时，对大豆幼苗地上部分和地下部分生长均有抑制作用，且差异达到显著水平，与CK相比地上鲜质量、地上干质量、地下鲜质量、地下干质量、总鲜质量、总干质量分别减少了 38.43%、54.93%、38.13%、70.83%、38.18%、62.18%。隨着胁迫浓度的增加，Cu2+胁迫对大豆幼苗地上和地下部分生长的抑制效果越明显，Cu2+胁迫浓度在400 μg/g下，地上鲜质量、地上干质量、地下鲜质量、地下干质量、总鲜质量、总干质量最小，与CK相比分别减少了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。

3 討论与结论

铜作为植物正常生命活动所必需的微量营养元素，广泛参与各种生命活动[20]。然而过量的铜含量将影响植物细胞代谢和离子平衡，对植物产生毒害作用，进而影响植物的正常生长[10，21]。正常情况下，植物体内存在活性氧清除系统，使植物在生命活动中产生的活性氧处于产生和消除的动态平衡，从而使植物免受活性氧伤害。当植物处理胁迫逆境时，活性氧动态平衡被打破，产生大量活性氧，促使植物脂膜和细胞器膜的严重过氧化，MAD含量升高，进而导致光合色素含量下降，影响植物的光合作用，因此MDA含量一定程度上能反映植物体活性氧的含量[22]。短时（5 d）低浓度的Cu2+胁迫20～200 μg/g与同期对照组相比，MDA含量变化不显著，但随着时间的延长（10～15 d），低浓度的Cu2+胁迫20～200 μg/g 将会引起MDA含量的显著变化;而短时（5 d）高浓度的Cu2+胁迫400 μg/g与同期对照组相比，MDA含量差异达到显著水平。这可能是因为短时低浓度Cu2+胁迫并未破坏植物体内活性氧动态平衡，但随着胁迫时间的延长，Cu2+离子胁迫打破植物体内活性氧动态平衡，导致活性氧大量产生，MAD含量升高;而高浓度的Cu2+胁迫迅速破坏植物体内活性氧动态平衡，引起MDA含量的显著升高。本研究中发现，随着Cu2+胁迫处理时间的延长，MDA含量逐渐升高（图1），类似的研究结论也在玉米[5]、水稻[6]、小麦[23]、棉花[24]、竹子[25]和油菜[14]中发现，因而膜脂过氧化可能是Cu2+毒害植物的重要途径，而MDA是膜脂过氧化的产物，因此MDA是表征Cu2+毒害的重要指标。

本研究结果表明，Cu2+胁迫能够显著增强POD的活性，这与一些学者在玉米[26]、穿心莲[27]的研究结果一致;低浓度的Cu2+胁迫对SOD活性的影响不显著，高浓度的Cu2+胁迫显著降低SOD活性，这与一些学者在水稻和空心连中关于Cu2+胁迫对SOD活性低促高抑的结论不一致[6，28]，这可能与植物生长环境、胁迫处理时间和研究作物品种有关。Cu2+胁迫处理下，2种抗氧化酶SOD和POD活性表现不一，原因是铜对抗氧化酶活性的影响可能同时表现为促进和抑制2个方面。一方面，过量Cu2+明显提高POD在转录水平的表达，诱导同工酶的表达，以及对酶蛋白结构进行加工与修饰，提高POD的总活性[29];另一方面，Cu2+胁迫下产生的活性氧可以破坏SOD合成的DNA、RNA和蛋白质的结构，从而破坏SOD的表达系统和结构，降低酶的活性[30]。关于20～400 μg/g Cu2+胁迫是否促进POD同工酶表达破坏合成SOD的相关DNA、RNA和蛋白质结构是进一步研究的方向。

本研究以不同浓度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+对大豆幼苗进行胁迫处理，研究外源Cu2+对大豆幼苗的毒害机理，分别测定胁迫处理后5、10、15 d大豆幼苗MDA含量、SOD活性、POD活性和根茎干鲜质量等指标，发现随着Cu2+胁迫浓度的增加及胁迫时间的延长，MDA含量升高、SOD活性下降、POD活性升高、根茎干鲜质量减少。表明Cu2+胁迫抑制大豆幼苗的正常生长，MDA是表征Cu2+毒害的重要指标，为大豆幼苗的Cu2+毒害机理提供依据。

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