狼毒大戟总提取物对乳腺癌细胞增殖及周期的影响

李美男

【摘要】目的：观察狼毒总提取物对乳腺癌细胞增殖及周期影响。方法：CCK-8法测定该药对MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3细胞株增殖影响，流式细胞术检测狼毒总提取物对MCF-7细胞周期影响。结果：狼毒总提取物对细胞IC50浓度分别为227ug/ml、793ug/ml、1034ug/ml。药物作用随着药物浓度提高。MCF-7周期检测，G0/G1期期比例下降、S期比例上升。结论：狼毒提取物对MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3细胞生长均有抑制作用。主要研究了MCF-7细胞抑制机制，提示狼毒大戟总提取物抑制MCF-7细胞G₂/M期到G。/G₁其转换。

【关键词】狼毒大戟;乳腺癌;细胞增殖

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率增長逐渐呈现年轻化趋势，预计2021年，中国乳腺癌发病率将位居肿瘤发病率的第二位，乳腺癌患者将高达250万，严重威胁女性的身体健康。乳腺癌的发生跟人体内激素水平、遗传因素、饮食习惯、生殖因素等有关，占女性新发癌症总数约25%，死亡率高，严重威胁了广大女性的生命和健康。目前乳腺癌的西医治疗以手术治疗、内分泌治疗、放射治疗、分子靶向治疗等为主要治疗手段。但多数患者仍出现复发转移、耐药及放化疗给患者带来的不同程度毒副作用，因此利用中药进行综合调节治疗也是近年来研究的热点领域。中药治疗能够有效地减轻患者的临床症状，提高他们的生存质量，并防止肿瘤细胞的复发转移，同时还可以与放化疗配合增效减毒。因此从天然产物中寻找抗肿瘤化合物己经成为抗肿瘤药物研发的重要方向。

狼毒大戟首记载于《神农本草经》，一般取其根部入药，味辛、性平、有毒，入肺、肝经，有逐水祛痰，散结杀虫的功效。《本经》中就有：“狼毒破积聚，治恶疮，消盎毒”的论述。狼毒大戟含有多种黄酮类、二萜类、倍半萜类、香豆素类、木脂素类及苯丙素苷类等化学成分，现代药理研究学表明，狼毒的水提液、醇提液或者不同种的炮制品均表现出一定的抗肿瘤活性。本实验主要探讨狼毒大戟对体外培养的不同类型的乳腺癌细胞的增殖影响。

1材料

1.1试剂与药品

狼毒大戟总提取物由沈阳药科大学药学院提供。

1.1.1试剂

1640培养液、DMEM培养液购于Hyclone公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS购于Genvew公司;胎牛血清购于Clark公司;CCK-8试剂购于Vazyme公司;碘化丙锭溶液购于北京鼎国盛生物技术有限公司。

1.1.2瘤株

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231（三阴型）、MCF-7（luminal A型）、SK-BR-3（HER2阳性型）均购于中科院上海细胞库。

1.2仪器

Thermo Scientific生物安全柜（购于美国公司Thermo Fisher Scientific公司）;二氧化碳培养箱（美国Thermo FisherScientific公司）;Olympus CKX31倒置显微镜（上海赖式电子科技有限公司）;ACCergraX-15R台式冷冻离心机（美国Beckman coulter公司）;Mettler Toledo型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;FLUOstar Omega型多功能酶标仪（德国BMG公司）FACSCaulibur流式细胞仪（美国BD公司）。

2实验方法

2.1细胞培养

LminalB型人乳腺癌细胞MCF-7采用10%胎牛血清的1640培养基、三阴型人乳腺癌细胞MDA-MB-231、Her-2阳型人乳腺癌SK-Br-2细胞采用15%胎牛血清的DMEM高糖培养基于5%C0₂，37℃培养箱培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2CCK-8

2.2.1收集细胞

将长至80%细胞消化离心，加入全培养液，细胞计数，每lOOul约6×10³个细胞，加细胞悬液100ul到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充），设置空白组（无细胞）和对照孔（培养基不加药，有细胞）。置37℃，5%CO₂孵箱孵育过夜。

2.2.2加药

取出96孔板，吸出培养液，每孔加入100uF孔狼毒总提取物，设置5个药物浓度梯度，分别为1000ug/ml、500ug/ml、300ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、30ug/ml、10ug/ml、lug/ml、每个浓度5个复孔，于5%C0₂的培养箱内，在37℃>条件下培养24h。

2.2.3CCK-8检测OD值

每孔加入10ul CCK-8溶液，孵箱孵育2h后检测，450nm各孔吸光值，计算OD值公式为细胞活性%=（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）x100%。

2.3细胞周期

2.3.1收集细胞

取对数生长期的MCF-7细胞的，以每个孔2x10⁶细胞密度接种于六孔板，孵箱孵育24h。

2.3.2加药

每孔加入100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的狼毒总提取物，设置阴性对照组（不加药物不加PI染液）及空白组（不加药物加PR染液）于5%CO₂，37℃孵育24h。

2.3.3染色流式仪检测

将六孔板中细胞消化离心，用预冷PBS冲洗一遍，加入75%乙醇轻轻吹匀细胞，4℃过夜。3000转10min离心，收集细胞，用预冷PBS吹洗1遍，加入碘化丙锭（PI染液）冰上孵育30min，PBS冲洗一遍，上机检测。计算细胞周期。

3结果

3.1不同浓度药物对乳腺癌细胞增殖的影响

不同浓度狼毒总提取物作用于乳腺癌细胞24h后，MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3，细胞增殖均有不同程度影响，其IC50分别为227ug/ml、793ug/ml、720ug/m1。对各种细胞系敏感程度排序为MCF-7>MDA-MB-23I>SK-BR-3。结果见表1、图1。

3.2狼毒大戟对MCF-7增殖周期影响

不同药物浓度作用后，低、中、高药物浓度和阴性对照组G₁期细胞所占比分别为：68.92%、66.71%、64.6%、57.22%;G2期分别为12.65%、15.33%、19.1%、30.32%。结果见图2。结果表明，随之狼毒大戟总提取物浓度的增加，G₀/G₁其比例逐渐下降，G₂期上升，提示狼毒大戟总提取物抑制MCF-7细胞GJM期到G₀/G₁。其转换。

4结论

狼毒大戟是大戟科狼毒属植物，俗称猫眼草，中医记载其主要用于治疗水肿腹胀、结核、虫积疥疮、积聚等疾病。现代药理学研究发现，其具有抗菌、抗病毒、调节免疫力、抗肿瘤等作用。近几年来对狼毒大戟提取物抗肿瘤的报道越来越多，狼毒大戟中主要有二萜类、黄酮类、香豆素类化合物、木脂体类等化学成分，杨瑾等研究表明，狼毒大戟提取物可以影响人肝癌细胞上皮间质化。孟明静等研究表明狼毒水煎液可抑制A549细胞生长，并对其迁徙也有一定影响。在临床上，狼毒大戟干品制成的注射液，对肺癌、乳腺癌均有一定疗效、杨德全用狼毒二鳖消积汤治疗原发性肝癌3个月。结果表明：显效9例，有效11例，无效5例，总有效率达80%。

由于狼毒大戟为中药制剂，其成分復杂，本实验选用了狼毒大戟总提取物为研究对象，试探讨狼毒总提取物对乳腺癌的作用机制，CCK-8结果表明，狼毒总提取物对乳腺癌细胞的增殖有抑制作用，针对三种类型乳腺癌细胞，MCF-7对狼毒总提取物最为敏感，周期结果表明，狼毒总提取物作用于培养的MCF-7人乳腺癌细胞24h，使细胞周期阻止在G2/M期，本研究初步证明了狼毒大戟总提取物具有抗乳腺癌细胞的活性，并且是通过阻止细胞周期来影响细胞的增殖，但其具体机制还需进一步研究。