阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进乳腺癌TAM向M1表型极化

何少忠（通信作者），毛亚婷，王群，廖桂祥（通信作者）

1 深圳市宝安区中心医院肿瘤科 （广东深圳 518102）；2 桂林医学院附属医院肿瘤科 （广西桂林541004）；3 深圳市人民医院放疗科 （广东深圳 518020）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤首位。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是外周血单核细胞迁移浸润到肿瘤组织的巨噬细胞，是乳腺癌免疫微环境中最丰富的免疫细胞，在促进乳腺癌进展与免疫逃逸中发挥关键的桥梁作用[1-5]。根据TAM活化类型及其在肿瘤微环境中作用不同，主要分为两种极化类型，即经典活化M1型和替代活化M2型，M1型主要诱导Th1型免疫应答，产生细胞毒作用杀伤肿瘤；M2型主要诱导Th2型免疫应答，抑制炎症促进肿瘤生长[6-9]。VEGF/VEGFR-2信号通路在肿瘤血管生成中起关键作用，有研究报道VEGF促进巨噬细胞迁移募集到肿瘤组织形成TAM，而VEGF/VEGFR-2信号通路是否参与TAM的极化表型调控[10-13]。本研究试想通过阻断VEGF/VEGFR-2信号传导，以促进乳腺癌TAM向M1表型极化，促进炎症反应。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

小鼠乳腺癌4T1细胞及小鼠单核细胞-巨噬细胞RAW264.7（中科院上海细胞库），4T1细胞使用含10%灭活胎牛血清的PRMIl640培养基进行培养和传代，RAW264.7细胞使用含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养和传代。

1.1.2 主要试剂

细胞培养基RPMI 1640、细胞培养基DMEM、胰蛋白酶EDTA消化液、胎牛血清（FBS）及无血清Opti-MEMI培养基（美国Gibco公司），小鼠细胞因子（IL-10、IL-12、VEGF、ELISA、TGF-β）检测试剂盒（美国Invitrogen公司），Alexa Fluor® 488 anti-mouse CD206、PerCP anti-mouse F4/80、APC anti-mouse CD16/32抗体（美国Ebioscience公司），慢病毒（赛业生物），阿帕替尼（江苏恒瑞公司），贝伐单抗（上海罗氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 诱导鉴定TAM细胞模型，检测VEGFR-2蛋白表达

将小鼠乳腺癌细胞4T1细胞接种于25 cm2培养瓶中，加入适量完全培养基，细胞培养24 h后，收集培养液并用0.22 μm过滤器过滤得到4T1细胞上清液。将RAW264.7细胞细胞接种于25 cm2培养瓶中，长到60%～70%底面积时，弃掉原来培养液，加入4T1细胞上清液继续培养48 h，诱导形成TAM细胞。流式细胞术检测诱导前后TAM表型，ELISA检测诱导前后细胞因子的变化和WB检测诱导前后VEGFR-2蛋白表达。

1.2.2 阻断VEGF/VEGFR-2 信号传导对TAM表型的干预实验

取处于对数生长期的RAW264.7细胞，加入4T1细胞上清液培养48h后，诱导形成TAM细胞。与未干预TAM组对比，设4个TAM干预组，分别为VEGFR-2基因siRNA组、VEGF抗体（贝伐单抗）阻断组、VEGFR-2受体抑制剂（阿帕替尼）阻断组、贝伐单抗+阿帕替尼联合阻断组。VEGFR-2基因siRNA组用慢病毒转染TAM细胞沉默VEGFR-2的表达，贝伐单抗组和阿帕替尼组分别用20 μg/ml贝伐单抗和8 nM阿帕替尼作用24 h，贝伐单抗+阿帕替尼药物联合干预组则联用20 μg/ml贝伐单抗+8 nM阿帕替尼处理24 h。收集细胞后流式细胞术检测TAM表型、ELISA检测细胞因子的变化和WB检测VEGFR-2表达，明确阻断VEGF/VEGFR-2 信号传导对TAM表型的影响。

1.2.3 TAM迁移实验

将1.2.2各组处理后细胞用胰酶消化细胞成单个细胞，加入transwell小室上室，下室加入培养液，放入37 ℃培养箱中培养48 h，取出上室用固定液固定20 min，将膜取下结晶紫染色，封片，镜下拍照。倒置显微镜下观察上室外表面细胞，各取5个视野。脱色处理后在550 nm处酶标仪测定吸光度（OD）值，与未干预TAM组对比，检测4个干预阻断组TAM侵袭能力的改变。

1.2.4 TAM吞噬实验

将1.2.2各组处理后细胞弃培养液培养，对照孔加0.5 ml 0.9%氯化钠注射液，其余每孔加0.5 ml 0.075%中性红，继续培养1 h，倾去上清液，用PBS洗涤，每孔加入细胞溶解液，室温下放置30 min。待细胞溶解后，即用分光光度计测定OD值，检测未干预TAM与4个干预阻断组TAM的吞噬能力的改变。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，所有实验重复3次，计量资料以±s表示，率的比较采用方差分析，采用bonfernoni分析总体及总体中两样本均数之间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAM细胞诱导模型呈M2型极化

2.1.1 TAM细胞呈M2型极化

流式细胞术检测小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导培养RAW264.7小鼠单核细胞-巨噬细胞48 h后细胞表面分子标志的表达，M1型（表面分子标记 F4/80+CD16/32）细胞比例由诱导前12.95%降低至诱导后4.47%（P＜0.05），M2型（表面分子标记F4/80+CD206）细胞由诱导前4.44%升高至诱导后18.51%（P＜0.05）。见图1和表1。

图1 流式细胞术检测细胞诱导前后表面分子变化

表1 M1、M2型细胞诱导前后比较（%，±s）

表1 M1、M2型细胞诱导前后比较（%，±s）

注：与诱导前RAW264.7组比较，aP＜0.001

组别 M1（CD16/32+） M2（CD206+）诱导前RAW264.7组 12.95±2.61 4.40±0.62诱导后TAM组 4.47±0.50a 18.51±3.14a

2.1.2 TAM细胞分泌Th1型细胞因子减少，Th2型细胞因子分泌水平增高

M1和M2型巨噬细胞分别通过分泌Th1型细胞因子（IL-12）和 Th2型细胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β 及ARG-1）来发挥免疫调节的作用。ELISA检测结果显示，4T1细胞上清液诱导培养RAW264.7细胞后Th1型细胞因子（IL-12）分泌减少（P＜0.05），Th2型细胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌增多（P＜0.05）。见图2。

图2 ELISA检测细胞诱导前后细胞因子变化

2.2 M2型TAM高表达VEGFR-2受体

2.2.1 TAM细胞高表达VEGFR-2蛋白

Western Blot检测经小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导培养RAW264.7后VEGFR-2蛋白的表达，诱导后TAM细胞VEGFR-2蛋白含量增高（P＜0.05），是诱导前细胞的2.5倍。见图3。

图3 WB检测VEGFR-2的蛋白表达

2.2.2 M2 型TAM高表达VEGFR-2蛋白受体

流式细胞术双染检测小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7经小鼠乳腺癌细胞4T1上清液诱导48 h后M1与M2型TAM中VEGFR-2膜蛋白的表达，M2型细胞的比例由50.1%升高到83.1%（P＜0.05），VEGFR-2蛋白在M2型细胞中的比例由33.7%上升至48.5%（P＜0.05），而VEGFR-2蛋白在M1型细胞中比例改变不明显。见图4和表2。

2.3 阻断VEGF/VEGFR-2信号传导能够逆转M2-TAM表型，促进TAM向M1极化

RAW264.7小鼠单核-巨噬细胞加入4T1细胞上清液诱导培养48h后得到TAM细胞。将上述细胞分为5组，分别为TAM空白对照组、VEGFR-2沉默组、VEGF抗体（贝伐单抗）阻断组、VEGFR-2受体抑制剂（阿帕替尼）阻断组和贝伐单抗+阿帕替尼联合阻断组。通过siRNA技术干扰TAM细胞VEGFR-2表达、VEGF抗体（贝伐单抗）、VEGFR-2受体阻断剂（阿帕替尼）及贝伐单抗+阿帕替尼药物联合分别阻断VEGF/VEGFR-2信号传导对TAM极化表型的影响，结果提示阻断VEGF/VEGFR-2信号传导能够逆转 M2-TAM表型，促进TAM向M1极化。

图4 流式双染检测诱导前（RAW264.7）与诱导后（TAM）M1与M2型VEGFR-2受体表达

表2 M1、M2型VEGFR-2的诱导前后比较（%，±s）

表2 M1、M2型VEGFR-2的诱导前后比较（%，±s）

注：与诱导前RAW264.7组比较，aP＜0.05

组别 M1（CD16/32+）VEGFR-2+M1（CD16/32+）M2（CD206+）VEGFR-2+M2（CD206+）诱导前RAW264.7组 97.9±3.0 94.3±3.1 50.1±12.7 33.7±5.6诱导后TAM组 99.2±1.2 85.4±5.2 83.1±13.6a 48.5±6.1a

2.3.1 Western Blot 检测VEGFR-2的表达

相比于空白对照组，siRNA沉默TAM细胞VEGFR-2蛋白或药物阻断VEGF/VEGFR-2信号传导导致了VEGFR-2蛋白表达水平的降低（P＜0.05）。见图5。

图5 WB检测TAM干预前后VEGFR-2蛋白表达

2.3.2 阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进TAM表型向M1极化

相比于空白对照组，siRNA沉默TAM细胞VEGFR-2蛋白或药物阻断VEGF/VEGFR-2信号传导导致M1型TAM比例升高（P＜0.05），M2型TAM比例下降（P＜0.05）。见图6和表3。

图6 流式细胞术检测细胞干预前后表面分子变化

表3 M1、M2型细胞干预前后比较（%，±s）

表3 M1、M2型细胞干预前后比较（%，±s）

注：与TAM空白对照组比较，aP＜0.05

组别 M1（CD16/32+） M2（CD206+）TAM空白对照组 6.23±0.58 18.36±0.91 VEGFR-2沉默组 9.78±1.25a 10.52±0.61a贝伐单抗阻断组 9.37±0.61a 12.67±1.46a阿帕替尼阻断组 10.71±1.00a 8.23±0.30a贝伐单抗+阿帕替尼阻断组 10.88±0.89a 5.48±0.46a

2.3.3 阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进Th1型细胞因子分泌，减少Th2型细胞因子分泌

相比于TAM空白对照组，siRNA沉默TAM细胞VEGFR-2蛋白或药物阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进TAM表型向M1极化后，Th1型细胞因子（IL-12）分泌增多（P＜0.05），Th2型细胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌减少（P＜0.05）。见图7。

图7 ELISA检测TAM细胞干预前后细胞因子变化

2.4 TAM迁移实验及吞噬实验

Transwell结果表明，相比于TAM空白对照组，siRNA 沉默TAM细胞VEGFR-2蛋白或药物阻断 VEGF/VEGFR-2信号传导促进TAM表型向M1型极化，TAM迁移能力增强（P＜0.05）（图8a）。中性红吞噬实验结果提示阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进乳腺癌TAM向M1表型极化后，TAM细胞的吞噬能力增强（P＜0.05）（图8b）。

图8 TAM表型向M1型极化后

3 讨论

TAM在乳腺癌浸润免疫细胞中的比例高达50%，促进乳腺癌的发生发展，导致乳腺癌复发及预后不良，越来越受到研究人员的重视[14-16]。TAM极化表型是影响肿瘤微环境免疫状态的重要因素[17]。肿瘤微环境中TAM主要被诱导极化为M2型，特征性表达 CD206、CD163，高表达抗炎细胞因子IL-10，低表达促炎细胞因子IL-12，分泌VEGF、TGF-β及CCL-22，产生精氨酸酶（Arg-1），诱导Th2型免疫应答，导致了免疫逃逸[18-20]。

本研究通过小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导培养RAW264.7小鼠巨噬细胞，模拟肿瘤微环境，细胞实验进一步证实TAM细胞诱导模型呈M2型极化，同时TAM细胞分泌Th1型细胞因子减少，Th2型细胞因子及VEGF分泌水平增高。

VEGF是血管内皮生长因子，VEGFR-2是VEGF的跨膜受体，由胞外区、膜区及胞内酪氨酸激酶区组成，VEGFR-2受体和VEGF配体结合从而激活催化域内酪氨酸激酶，导致受体磷酸化而引起胞内酶联反应；介导肿瘤异常血管新生VEGF/VEGFR-2信号通路在肿瘤血管生成中起关键作用[21-22]。此外，有研究报道肿瘤缺氧微环境诱导VEGF表达后，将吸引巨噬细胞迁移浸润到肿瘤组织形成TAM，且TAM自身分泌VEGF形成正反馈，刺激局部血管形成募集更多的巨噬细胞浸润肿瘤组织[23-24]。如何打破TAM形成的免疫抑制微环境，是肿瘤免疫治疗面临的重要问题[25]。本研究通过阻断VEGF/VEGFR-2信号传导，以促进乳腺癌TAM向M1表型极化，促进炎症反应。

本研究通过siRNA沉默小鼠巨噬细胞VEGFR-2基因、VEGF抗体（贝伐单抗）、VEGFR-2受体阻断剂（阿帕替尼）及贝伐单抗+阿帕替尼药物联合阻断VEGF/VEGFR-2信号传导，研究对TAM极化表型功能的影响。结果显示，阻断VEGF/VEGFR-2信号传导导致VEGFR-2蛋白表达降低后，能够逆转M2-TAM表型促进TAM表型向M1型极化，同时促进Th1型细胞因子分泌，减少Th2型细胞因子分泌，增强TAM的迁移、吞噬，促进炎症反应，证实通过阻断VEGF/VEGFR-2信号传导从而促进TAM向M1型极化，对于调控肿瘤微环境中TAM表型功能具有重要意义。

综上所述，阻断VEGF/VEGFR-2信号传导能够逆转M2型TAM，促进TAM向M1型极化，增强TAM迁移吞噬能力，促进炎症反应。我们将进一步构造动物模型，开展体内研究证实阻断VEGF/VEGFR-2信号传导逆转M2型TAM与T细胞活化的作用与机制。