不同提取方法对太子参多糖含量的影响

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1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003

福建道地药材太子参在柘荣县已有近百年的人工栽培历史，太子参的生产、加工成为当地支柱型产业。多糖是太子参中重要活性成分之一，研究表明，太子参多糖具抗氧化[1]、免疫调节[2]、抗糖尿糖[3-4]、及心肌保护[5]等多种活性。太子参多糖的高效生产对于太子参产业的发展尤为重要，在多糖生产过程中，如何在提高提取率的同时，降低生产能耗和成本，是多糖生产工艺中的难点。

目前，中药多糖提取方法主要有热水提取法、酸/碱提取法、超声波提取法、微波提取法、酶提取法、超临界萃取法和超高压提取等，其中热水提取法工艺成本较低、操作简单，是最传统的提取方法；超声提取具有时间短、效率高、节约能耗等特点；酶提取法可有效破坏药材致密的细胞壁结构，促进多糖的溶出[6]。本研究分别采用热水提取法、超声提取法、酶提取法3种方法提取太子参多糖，比较不同提取方法对太子参粗多糖的得率、总多糖含量的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-3200型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；AE240S电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KQ2200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Sorall ST 16R高速冷冻离心机(Thermo Fisher公司)；MOKULYOD-230型冷冻干燥仪(Thermo Fisher公司)。

1.2 材料 太子参药材购于福建柘荣太子参市场；纤维素酶(批号：20170309)、乙醇(批号：20170424)、苯酚(批号：20161018)等购于国药集团化学试剂有限公司；硫酸(批号：160123，西陇化工股份有限公司)；D-无水葡萄糖对照品(批号：110833-201506，中国食品药品检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 多糖的提取

2.1.1 热水提取法 精密称取太子参粉末20.00 g，加入400 mL蒸馏水，回流提取1 h，滤渣重复提取2次，合并3次续滤液，旋蒸浓缩至约100 mL；加入4倍量无水乙醇，4 ℃静置过夜，离心(4000 r/min, 10 min)，收集沉淀。向沉淀中加入100 mL蒸馏水，充分溶解，重复醇沉1次。收集沉淀冷冻干燥，称重，计算粗多糖得率，既得热水提取法太子参粗多糖。

2.1.2 超声提取法 精密称取太子参粉末20.00 g，加入400 mL蒸馏水，超声(350 W，40℃)提取0.5 h，滤渣重复提取2次，合并3次续滤液后处理方式同热水提取法，既得超声提取法太子参粗多糖。

2.1.3 酶提取法 精密称取太子参粉末20.00 g，加入400 mL蒸馏水，加入0.5 g纤维素酶55℃浸泡1 h，煮沸10 min对酶进行灭活，过滤，滤渣重复提取2次，合并3次提取所得滤液后处理方式同热水提取法，既得酶提取法太子参粗多糖。

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制 准确称取D-无水葡萄糖对照品20.02 mg，加蒸馏水溶解，定容至200 mL容量瓶中，配制成浓度为100 μg /mL的对照品储备液，分别精密量取葡萄糖标准品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 置于10 mL 的具塞试管中，分别添加蒸馏水至2 mL，并且各加5%苯酚溶液1 mL，混匀，缓缓加入硫酸5 mL，摇匀；沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min。用1 mL蒸馏水按同法反应作为空白对照，分别在490 nm 波长处测定吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。并得到回归方程：y=0.0072x+0.0167，r=0.9991，表明葡萄糖在10.01～90.09 μg/mL范围内线性关系良好。标准曲线如图1所示。

2.2.2 精密度试验 精密称取太子参粗多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，精密吸取太子参多糖溶液1mL，共6份，分别置10 mL具塞试管中按标准曲线项下方法显色，测定吸光度，计算其相对标准偏差RSD为3.35%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密吸取太子参粗多糖供试液，按标准曲线项下方法显色，分别于0、15、30、60、90、120 min测定吸光度，考察其稳定性，结果相对标准偏差RSD为0.72 %，表明在120 min内样品具有良好的稳定性。

2.2.4 重现性试验 精密称取太子参粗多糖5份，按标准曲线项下方法显色，测定吸光度，计算其相对标准偏差RSD为2.56%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 精密称取太子参粗多糖10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，准确移取供试液8份，每份5 mL，转移至10 mL容量瓶，分别加入0.5 mg/mL葡萄糖溶液0、0.5、1、1.5 mL，加超纯水定容至刻度，测定吸光度，计算含量及回收率，加样回收率试验结果见表1。

2.2.6 总多糖的测定 精密称取不同提取方法的太子参粗多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入超纯水，超声溶解，定容。精密吸取各多糖溶液1 mL，按照上述标准曲线方法进行显色反应后测定吸光度，代入标准曲线计算各多糖含量。

表1 葡萄糖加样回收率测定结果

表2 不同方式提取得到的太子参粗多糖得率及总多糖含量比较

通过对不同提取方式得到的粗多糖得率及总多糖含量进行对比(表2)，结果显示太子参粗多糖得率受提取方法的影响很大，热水提取法、超声提取法和酶提取法获得太子参粗多糖得率分别为14.54%、11.12%和17.81%，粗多糖得率由高至低依次为酶提取法>热水提取法>超声提取法。酶提取法所得粗多糖与热水提取法和超声提取法相比纯度较低。热水提取法(10.18%)和酶提取法(10.69%)所得太子参总多糖含量相当，均高于超声提取法(8.68%)。

4 讨论

研究采用热水回流提取法、超声提取法和酶法分别提取太子参多糖，结果显示热水回流和酶法提取所得粗多糖得率高于超声提取法。回流提取法较高的提取温度有利于提取溶剂进入药材内部，增加药材与提取溶剂的接触；酶提取法利用纤维素酶分解太子参细胞壁结构，在一定程度上可以促进细胞内部多糖的溶出和提高太子参中纤维素源多糖的提取率，因此，热水回流和酶提取法更有利于太子参多糖的高效提取。在实用性方面，超声波提取法需要专门设备，且设备要求技术含量较高，不适用于工业化大生产。酶提取法所需设备简捷，操作简便，但存在提取成本较高和多糖产物纯度较低等问题。热水回流提取法在工业上已有较成熟的提取设备，且提取时间短、提取率高，较为适用于太子参多糖的生产。

该试验采用的室温条件下超声提取法对太子参多糖提取率要低于热水提取法和酶提取法，说明较高的温度可能更有利于太子参多糖的溶出，但是高温的提取环境容易破坏多糖的空间结构，从而影响其生物活性；而相对较低的提取温度，可能会更好的保持多糖独特的性质[7]，关于不同提取条件下太子参多糖生物活性的研究有待进一步深入。