红花伪品及其染色物的检测探讨

山西省晋城市食品药品检验所，山西 晋城 048000

红花始载于《开宝本草》，原名“红蓝花”[1]。中华人民共和国药典规定其来源为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通经，散瘀止痛之功效[2]。主治妇女月经不调、痛经闭经，还适用于各种静脉曲张、末梢神经炎、跌打损伤、关节酸痛、腿脚麻木等症。红花为临床常用品种，由于用途广泛，货源紧张，导致价格上涨，为卖相好看或造假，市场上掺伪染色现象时有发生，如有报道红花饮片被酸性红73、日落黄染色[3-4]，严重影响药品疗效，危害人类健康。近期笔者在日常工作中发现一种红花的伪品，大小和颜色与红花较为相似。为有效打击这种违法行为，提供有力证据，本文首先从性状入手，辅以水试，对红花与其伪品进行了鉴别，同时发现可能有非法染色物存在，进而通过HPLC法对染色物质进行了定性，并应用HPLC-MS法对染色物质做了进一步的确认，证实该伪品中含有胭脂红。对染色物确证时，采用了多反应监测和二级全扫描相结合的模式与相应的对照品进行比较，得出的结论更加可靠，以供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 OLYMPUS 520 照相机；OLYMPUS SZX7体式显微镜；Waters 2695高效液相色谱仪(2998二极管阵列检测器，美国Waters)；Waters AcQuity uplc XEVO TQD 高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪(美国Waters公司)；AUW120D型电子分析天平(日本岛津)；BRANSONIC 超声波清洗机(美国BRANSON)；Medium-s300超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 材料 胭脂红(批号：111771-201302)、柠檬黄(批号： 510004-201602)、金橙Ⅱ(批号：111769- 201302)、偶氮玉红(批号：520054-201401)、酸性红73(111773-201602)、日落黄(批号：510005-201602)等以上标准物质均购于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

实验用红花正品药材为2018年6月于市场收集；红花伪品为2018年7月抽检样品，实验样品均保存于晋城市食品药品检验所标本室。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 采用OLYMPUS SZX7体式显微镜观察微观形态特征，比较红花与其伪品的不同点，然后采用水试的方法，观察入水前后两者的差异以及水的颜色变化。红花为不带子房的管状花，长1～2 cm，表面红黄色或红色。花冠筒细长，先端5裂，裂片呈狭条形，长5～8 mm；雄蕊5，花药聚合成筒状，黄白色；柱头长圆柱形，顶端微分叉。质柔软。伪品与红花正品外观较为相似，表面橙红色，花药颜色为橙红色，质松脆。如图1所示。

2.2 水试 取红花及其伪品少许，分别加水25 mL，浸渍数分钟，滤液置于比色管中，日光下检视，红花滤液显淡黄色，伪品滤液显橙红色。将浸渍后的红花及伪品置于白纸上，日光下观察，红花颜色没有发生变化，伪品颜色退去，变成淡棕色。如图2、3所示。

2.3 HPLC-DAD法伪品染色物质的检测

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Waters XTERRA MS C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸铵溶液)按表1进行梯度洗脱；柱温30℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：508 nm；二极管阵列检测器检测波长范围：200～700 nm。

2.3.2 供试品溶液制备 分别取红花与其伪品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超声处理 20 min，滤过，取上清液作为供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备 取胭脂红对照品适量，加甲醇制成每1 mL含胭脂红60 μg的对照品溶液。

2.3.4 样品测定 取红花供试品溶液、红花伪品供试品溶液，以及对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

2.3.5 HPLC-DAD法结果 结果表明红花伪品供试品溶液中呈现与胭脂红对照品溶液保留时间一致的色谱峰，且对照品和供试品中相应色谱峰在200～700 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱相同。如图3、4所示。

2.4 HPLC-MS法检测

2.4.1 色谱-质谱条件 色谱柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸铵溶液)按表2进行梯度洗脱；流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL。质谱条件离子源：电喷雾ESI；电离方式：ESI+ ；电喷雾电压：0.7KV；离子源温度：500℃；载气流速：1000 L/H。扫描方式：多反应监测扫描、 二级质谱全扫描，扫描范围m/z 50～550，具体质谱参数见表3。

表1 HPLC-DAD 梯度洗脱条件

表2 HPLC-MS 梯度洗脱条件

表3 化合物的基本信息及MRM参数

注：二级质谱全扫描锥孔电压为36V，碰撞能量为30eV

2.4.2 供试品溶液制备 取红花伪品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超声处理 20 min，滤过，取上清液作为供试品溶液。

2.4.3 对照品溶液的制备 取胭脂红对照品适量，加甲醇制成每1 mL含胭脂红60 μg的对照品溶液。

2.4.4 样品测定 取空白试剂、红花伪品供试品溶液，对照品溶液分别稀释适当的倍数后进样，进行液相色谱-质谱联用分析。

2.4.5 HPLC-MS法结果 多反应监测扫描质谱图中，红花伪品出现与胭脂红对照试剂保留时间一致的准分子离子峰；在二级全扫描质谱图中，红花伪品出现与胭脂红对照试剂相同的离子碎片特征峰，进一步确证了红花伪品供试品种中添加有胭脂红色素(多反应监测质谱图、二级质谱图详见图5、6)。胭脂红的准分子离子[M-3Na+4H]+ 峰为m/z 539，其二级全扫描质谱的特征离子碎片为 158.13、223.00、316.08。

3 讨论

3.1 红花伪品的鉴别 研究发现伪品红花与正品红花性状差别主要体现在两个方面，一是质感，正品红花质地柔软，整体性好；伪品红花质地则较为松脆，整体性差，易散碎。二是花药，正品红花的花药颜色为黄白色，明显比外侧花瓣颜色浅；伪品红花的花药颜色为同外侧花瓣颜色一样为橙红色。分析认为这种现象是由于伪品经统一染色导致花瓣花药颜色均为橙红色，可以作为鉴别该伪品的关键特征。基于以上结论，本文可为基层执法提供一种快速鉴别可疑伪品的便利方法，尤其是在没有携带相关快速检测设备的情况下，可抓住此性状特征，对可疑品种第一时间进行控制，防止非法流通，具有一定社会效益。

3.2 染色物的检测 采用水试法，发现红花伪品入水后，褪色，怀疑其被染色，参考药品补充检验方法(国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件：2013007、2014016)对方法中涉及的色素进行检测，首先应用薄层色谱方法对偶氮玉红、酸性红73、日落黄、柠檬黄、胭脂红和金橙Ⅱ等6种染色物质进行了初筛，并在伪品供试品中检测到胭脂红种染色物质。在此基础上，参考相关文献报道的方法[5]，应用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法对伪品中染色物质做了进一步的确认，证实伪品中含有胭脂红。胭脂红与欧盟标准禁用的苏丹红Ⅰ同属于偶氮类色素，毒理学实验显示其有一定的致癌和突变作用，如果人在不知情的情况下长期使用了这种染色的红花，容易引起暂时性或持久性的病理状态，甚至危及生命，在药品中是不允许添加的。为此，本文建立的HPLC以及HPLC-MS方法，能够检测红花伪品中所掺入的胭脂红色素，为红花和其他药材中非法使用胭脂红的检测提供参考，同时也为药材中其他染色成分的检测提供借鉴，为大力打击中药染色这种违法行为提供技术支撑，确保中药质量，保证临床用药安全有效。

对红花伪品测定的同时，对红花正品和空白试剂也进行了考察，红花正品溶液和空白试剂在相应色素色谱峰位置均未出现干扰峰，表明本文所建立的对胭脂红色素检测的HPLC和HPLC-MS法专属性良好。参考文献[6-9]，对药品中违法添加色素的检测，通常最终采用液质联用法进行检出物的确认，具体方法是通过与对照品的一级质谱、二级质谱相比较，查看是否一致。本文采用多反应监测和二级全扫描相结合的模式进行测定，由于多反应监测可以通过对两级离子的选择，排除大量的干扰离子，降低了检测背景，所以本模式可以提高检测的灵敏度和准确度，为药品中色素类成分的检测提供新的思路。

综上，通过对一种红花伪品的鉴别，发现与正品红花有明显的性状差异，根据此鉴别点能够迅速进行初筛，可以用于快检；同时经过水试分析及现代分析仪器检测，发现了红花伪品中违法添加胭脂红染色物质，实验结果显示所建立的用于测定胭脂红的HPLC以及HPLC-MS方法专属性好，灵敏度高，可以为胭脂红以及其他染色物质的检测提供参考。