子宫内膜癌组织中长链非编码RNA ZEB1-AS1的表达与临床特征及对化疗药物耐药性研究*

李晓丽，胡陇娟

(1.宝鸡市妇幼保健院妇科，陕西宝鸡 721000；2.宝鸡高新人民医院产科，陕西宝鸡 721013)

子宫内膜癌是女性常见恶性肿瘤之一[1-2]，发病率目前处于逐年增加的趋势[3-5]，仅次于宫颈癌[6]。随着我国人口老龄化、晚婚晚育、不孕不育等情况增加，子宫内膜癌发病出现年轻化的趋势[7]，且死亡率持续增加[8-10]。研究报道[11]，在部分城市子宫内膜癌已成为最常见的女性生殖系统恶性肿瘤。当前，子宫内膜癌主要以手术治疗为主，放化疗为辅[12]，但越来越多的子宫内膜癌患者出现化疗耐药的情况[13]。鉴于此，本研究通过检测长链非编码RNA(long noncoding RNA，lnc RNA)ZEB1-AS1的表达与子宫内膜癌患者化疗后远期预后之间的关联，通过细胞生物学实验进行验证，旨在为子宫内膜癌化疗耐药提供科学依据。

1材料与方法

1.1 研究对象 本研究所有临床组织样本均为2013年1月～2017年12月收集于宝鸡市妇幼保健院妇科的子宫内膜癌患者，共计177例，患者平均年龄56.7±11.7岁。课题组前期每三个月对所有患者进行一次电话随访。

1.2 试剂和仪器 子宫内膜癌细胞系Ishikawa购于中国科学院上海细胞库。PCR仪购于ABI公司。细胞裂解液TRizol购于Life Technologies公司。逆转录试剂盒购于TAKARA公司。胎牛血清购于逍鹏生物公司(Biological Industries，Israel)，lnc RNAZEB1-AS1过表达质粒购于吉凯公司，转染试剂Lipofectamine 3000购于Invitrogen公司，引物订购于上海生工生物公司。氟尿嘧啶及顺铂订购于逍鹏生物公司。E-cadherin抗体、vimentin抗体和GAPDH均购于ABCAM公司。

1.3 方法

1.3.1 临床组织标本检测：采用RT-PCR方法检测临床肿瘤组织标本中lnc RNAZEB1-AS1的表达量。反应体系根据ABI公司说明书进行配制，数据采用2-ΔΔCt法进行分析；ACTB作为内参；取肿瘤组织相对表达量≥癌旁正常组织为高表达，反之为低表达。

1.3.2 细胞株相关实验：①细胞转染实验：严格按照说明书进行操作，转染后常规培养48 h，收集细胞用于后续检测。②CCK-8实验：取转染后处于对数生长期的细胞用于此实验。实验中，取胰蛋白酶消化重悬后的细胞进行计数，接种于96孔细胞培养板，每孔接种300个细胞，每组设置5个平行孔；接种5块96孔细胞培养板用于在不同时间点(0，24，48，72，96 h)加入CCK-8试剂，随后于450 nm波长下检测其吸光度，数值越高表示孔内细胞数越多。③化疗药物敏感度实验：取转染后处于对数生长期细胞用于此项实验。用胰蛋白酶消化重悬后的细胞进行计数，接种于96孔培养板，每孔接种2×105个细胞，每组设置5个平行孔；按细胞对数浓度梯度设置化疗药物(5-氟尿嘧啶、顺铂)的浓度梯度，加药，常规培养24 h后PBS清洗96孔培养板，加入含20 g/dl CCK-8试剂的培养基，2 h后于450 nm波长检测其吸光度，数值越高则表示孔内细胞数越多。

1.4 统计学分析 采用配对t检验分析癌组织和对应癌旁正常组织中lncRNA ZEB1-AS1表达水平的差异；采用卡方检验和独立样本t检验分析不同子宫内膜癌患者临床特征与疾病进展中lncRNA ZEB1-AS1表达水平的差异；采用K-M法绘制生存曲线；用Log-rank检验不同组患者生存时间之间的差异；使用独立t检验分析细胞迁移和侵袭能力差异；采用重复测量的方差分析方法分析细胞增殖能力的差异(CCK-8实验及化疗药物敏感度实验)。统计过程使用实验SPSS19.0软件进行，所有检验均为双侧检验，α=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 lnc RNA ZEB1-AS1在临床样本子宫内膜癌-癌旁组织中的表达 lnc RNA ZEB1-AS1在118例(66.7%)癌组织中高表达，59例(33.3%)癌组织中低表达，见表1。癌组织中的lnc RNA ZEB1-AS1表达量显著高于对应癌旁正常组织，达1.99倍(Mean±SD， 0.006 0±0.020 0 vs 0.003 0±0.014 1)，差异有统计学意义(P=0.035)，见图1。

图1 lnc RNA ZEB1-AS1在子宫内膜癌组织中高表达

2.2 lnc RNA ZEB1-AS1表达水平与子宫内膜癌患者临床特征间的关系 lnc RNA ZEB1-AS1高表达与低表达在子宫内膜癌患者肿瘤临床分期(χ2=14.293，P=0.001)、是否化疗(χ2=6.049，P=0.019)、是否原位癌(χ2=8.245，P=0.041)、是否淋巴结转移(χ2=10.427，P=0.005)、是否远端转移(χ2=20.229，P<0.001)以及HPV阴阳性(χ2=12.710，P=0.001)之间的差异均具有统计学意义。

2.3 lnc RNA ZEB1-AS1高表达与子宫内膜癌患者生存期缩短相关 lnc RNA ZEB1-AS1低表达组中位生存时间为35.0个月，高表达组中位生存时间为19.6个月，组间总生存率(overall survival，OS)差异有统计学意义，lnc RNA ZEB1-AS1高表达组总体生存率明显低于lnc RNA ZEB1-AS1低表达组，差异有统计学意义(χ2=9.33，P=0.002 3)，见图2。

表1 lnc RNA ZEB1-AS1表达水平与子宫内膜癌临床特征之间的关系[n(%)]

图2 lnc RNA ZEB1-AS1缩短子宫内膜癌患者生存期

2.4 过表达lnc RNA ZEB1-AS1促进子宫内膜癌细胞的增殖 当细胞增殖48 h后，过表达lnc RNA ZEB1-AS1组细胞增殖速度明显较对照组细胞快，差异有统计学意义。

转染0，24，48，72和96 h后进行检测分析，分别为过表达组vs干扰组(时间，P)：0.189±0.029 vs 0.187±0.00 9(0 h，P>0.05)，0.210±0.029 vs 0.200±0.016(24 h，P>0.05)，0.395±0.028 vs 0.337±0.040(48 h，P=0.044)，0.529±0.055 vs 0.398±0.061(72 h，P=0.013)和0.749±0.073 vs 0.568±0.035(96 h，P=0.002)，见图3。以上实验结果显示在细胞生长达到平台期前，随着培养时间的延长，过表达组和对照组细胞数间的差异愈明显，说明lnc RNA ZEB1-AS1能够明显促进子宫内膜癌细胞的增殖。

注：*P<0.05，** P<0.01。

2.5 过表达lnc RNA ZEB1-AS1可降低子宫内膜癌细胞对化疗药物的敏感度 过表达组对5-氟尿嘧啶的IC50为24.71±3.19 μmol/L，对照组为13.35±0.83 μmol/L(P<0.01)；过表达组对顺铂的IC50为43.33±6.45 μmol/L，对照组为12.21±1.21 μmol/L(P<0.01)。两种化疗药物处理后细胞的存活曲线见图4。两种药物实验结果均显示过表达lnc RNA ZEB1-AS1后细胞对5-氟尿嘧啶及顺铂的敏感度降低，表明lnc RNA ZEB1-AS1高表达能使子宫内膜癌细胞对5-氟尿嘧啶及顺铂药物的耐药性提高。

3讨论子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，给女性健康带来了严重伤害[3，14]。我国女性子宫内膜癌发病率仅次于宫颈癌[7-9]。子宫内膜癌多发生在女性绝经以后，另外我国人口老龄化速度加快、老龄化人口数量增加，导致我国子宫内膜癌患者数持续增加[15-16]。目前子宫内膜癌的治疗方式主要以手术治疗为主，放疗和化疗为辅，但化疗耐药比例逐渐升高[6，17]。研究显示长链非编码RNA(long non-coding RNA， lnc RNA)在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，且有文献报道lnc RNA广泛参与了肿瘤细胞的耐药过程[18-19]。

lnc RNA是一类在转录水平和转录后水平具有调控作用的非编码RNA，其在肿瘤耐药中的作用逐渐受到重视[18，20-21]。研究报道[22]lnc RNA ZEB1-AS1在胃癌中表达上调，与胃癌不良预后相关；JIN等[23]研究显示lnc RNA ZEB1-AS1在非小细胞肺癌中高表达，能够促进非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭；ZHANG等[24-25]研究显示，在胃癌细胞中，敲低lnc RNA ZEB1-AS1将通过与miR-335-5p作用共同抑制胃癌细胞的增殖。另有研究表明lnc RNA ZEB1-AS1在多种肿瘤中发挥促癌基因作用[26-31]，但目前尚未见到其在子宫内膜癌中的相关报道。本研究结果显示lnc RNA ZEB1-AS1在子宫内膜癌中高表达，且其高表达与子宫内膜癌患者淋巴结转移、远端转移、化疗相关，同时证实过表达lnc RNA ZEB1-AS1可促进子宫内膜癌细胞的增殖，降低其对顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感度，表明lnc RNA ZEB1-AS1在子宫内膜癌患者化疗耐药过程中发挥重要作用。

本研究发现lnc RNA ZEB1-AS1在子宫内膜癌组织中高表达，且其高表达与肿瘤转移、耐药等过程相关，但本研究尚未进行其具体分子机制的深入研究，仍需后续研究进行报道。