汤阴北艾精油及其主要成分对对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤的保护作用

2019-08-19曹瑞敏米克热木沙衣布扎提陈保君张守泉蒋志惠张小莺

兽医导刊 2019年20期

曹瑞敏米克热木·沙衣布扎提陈保君张守泉蒋志惠* 张小莺，*

（1.动物医学学院，新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830052；2.河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室，安阳工学院，河南安阳 455000；3.汤阴医药开发办公室，河南安阳 456150）

艾属菊科（Asteraceae）蒿属（Artemisia），是多年生草本或略成半灌木状宿根草本植物，植株有浓烈香气，广泛分布于亚高山地区草原[1]。北艾产自河南省安阳市汤阴县，是中国“四大名艾之首”。汤阴北艾之九头仙艾因扁鹊而得名，战国时期扁鹊在魏国汤阴邑一带行医，常用九头仙艾治病，北艾精油是北艾主要成分[2]。北艾以叶入药，主要活性成分有1，8-桉叶素、倍半萜烯醇及其酯等[3]，其中1，8桉油精具有抗氧化的作用[4]。该类植物的提取物具有抗肿瘤、抗炎、抗血小板凝聚、抑制NO生成、钙拮抗等活性作用[5]。因艾草药用功能显著且价格低廉，其在药用和保健上的关注度逐年上升。

对乙酰氨基酚（N-acetyl-para-aminophenol，APAP），是一种广泛使用的解热镇痛药，临床上常用于治疗感冒引起的发热和缓解轻疼痛[6]。APAP能迅速被肠道吸收并在肝脏内代谢，APAP安全剂量下疗效确切，用药可靠，大多数（85%-90%）由UDP-葡萄醛酸基转移酶和磺基转移酶催化，有10%的APAP通过细胞色素P-450酶代谢，特别是CYP2E1亚型酶代谢产生具有毒性的中间体N-乙酰基对苯醌亚胺（NAPQI）[7，8]。NF-κB是炎症的主要调节因子，NF-κB的激活与炎症反应强烈相关[9]。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在多种疾病的发病机制中起着重要的作用。大多数TNF-α基因多态性位于启动子地区，并且它们被认为是影响人类不同疾病的易感性和严重程度[10]。APAP诱导的肝功能异常除了与肝细胞线粒体结构变化以及氧化应激反应等有着紧密关系[11]。

北艾精油和1，8桉油精具有抗氧化、抑制炎症的作用，推测其具有潜在治疗药物性肝损伤的作用。为证明这一假设，我们利用APAP诱导的大鼠肝损伤模型，研究艾草精油及其主要成分1，8桉油精对肝脏损伤的保护作用及其机制，为北艾后续的研究提供数据和理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

实验昆明小鼠购于郑州大学实验动物中心，体质为20～25g。

1.2 主要试剂

北艾采自河南省安阳市汤阴县扁鹊庙，采摘时间为2018年5月；总mRNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒、SYBR@Green Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

气相色谱与质谱联用仪（5977A-MSD）购自美国安捷伦科技有限公司、实时荧光定量PCR （2720）购自Life Technologies有限公司、超高速离心机（5810R）购自上海艾研生物科技有限公司、光学显微镜（BX53）购自日本Olympus精密仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 北艾提取物的制备与鉴定

2.1.1 北艾精油的提取

艾叶经过自然晾干后粉碎，称取60 g艾绒溶于0.6 L蒸馏水中，95℃加热2 h，分离下层艾露，收集上层精油，重复3次。

2.1.2 北艾精油成分的鉴定

气相色谱条件为：H P-5 m s非极性毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），载气为氦气，流量10 mL/min，进样量2μl，初始温度70℃，采用程序升温以10℃/min速率升温至95℃，以5℃/min速率升温到125℃，以6℃/min速率升温到180°C，以20℃/min速率升温到280℃，分流比15∶1。

质谱分析条件为：离子源为EI，电离电压70eV，进样口温度200℃，离子源温度230℃，扫描范围30～600amu。

取上述挥发油10μL置进样瓶中，用甘油定容至10ml。按照“1.2.2色谱质谱条件”对艾草挥发油进行GC-MS分析，将分辨质谱数据与Demo、Nilt08谱库进行成分比对。

2.2 给药处理及分组

昆明小鼠，体重18～25g，动物饲养于恒温环境，自由进食。按随机分组原则将30只小鼠随机分为6组，每组5只，药物组提前0.5h给于APAP。分别为正常对照组（NC），APAP模型组（300mg/kg），N-乙酰-L-半胱氨酸阳性对照组（100mg/kg，NAC），APAP+北艾精油（100mg/kg，0.1%吐温80，APAP+EOs）组，APAP+1，8桉油精（28mg/kg，0.1%吐温80，APAP+1，8）组以及1，8桉油精对照组（28mg/kg，0.1%吐温80，1，8）。NAC组及各实验组按300mg/kg体重腹腔注射APAP，NC组腹腔注射相同体积的生理盐水。每组连续给药3d，给药间隔为8h。最后一次注射药物24h后，脱颈致死摘除小鼠肝脏，用0.9%生理盐水洗涤表面的血污，剪取肝脏部分右叶固定于4%甲醛固定液中，待24h后进行组织病理切片制备及形态学分析。剩余肝脏分装，-80℃保存，备用。

2.3 组织切片的制作与观察

剪取由4%甲醛固定液中的肝组织进行脱水透明、石蜡包埋，静置6～h，切片（5nm）后贴片放入37℃烘箱过夜，脱蜡，最后用苏木精和伊红（H&E）染色，封片镜检。

2.4 相关炎症因子mRNA的表达

根据总RNA提取试剂盒说明书进行样品提取，在260nm和280nm吸光度下检测RNA吸光度，符合两者比值1.8～2.0之间，使其浓度调节至1mg/L，取mRNA1μg进行cDNA反转录，将cDNA分装存放-80℃保存，备用。取cDNA反转录产物2μl，使用特异性引物直接扩增特异性cDNA（表1）。实时荧光定量q-PCR在QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System上使用SYBR®GreenMaster Mix检测。以β-actin作为内参，带入公式2-（ΔΔCt）将mRNA的目的基因与对照基因为相对表达的比率。

表1 cDNA片段实时荧光定量扩增引物Fig.1 The q-PCR primer of cDNA fragment

3 结果

3.1 北艾精油成分

采用GC-MS法分析北艾精油成分。各成分的质子总离子图如图1所示。从北艾精油中鉴定出各色谱峰的化学成分，除溶剂以外的全部峰面积作为100%，同时采用色谱峰面积归一化法计算出各成分的相对百分含量（表2）。结果显示，从北艾中共检测出15种化学成分，主要包括黄酮类、半萜类等，主要成分有1，8桉油精、龙脑、α-水芹烯和萜品油烯等，各占5.9%、11.4%、24.9%、11.0%和14.6%。

3.2 北艾精油和1，8桉油精缓解肝组织病变

1，8桉油精和正常对照组的肝细胞以中央静脉为轴心呈放射状，排列整齐，出现多细胞核（图2A，F）；APAP处理后引起严重肝细胞损伤，表现为肝细胞大量坏死、中心性脑泡变性和淋巴细胞浸润（图2B）。在APAP-EOs组中，小叶区肝细胞的一小部分表现为细胞质空泡，较APAP组坏死细胞明显减少，肝损伤明显减轻（图2D），1，8桉油精与NAC组（图2C，D）相似，与APAP组肝损伤相比有明显的区别。表明北艾精油和1，8桉油精能够缓解APAP引起的肝毒性病理变化，对肝损伤有明显的治疗作用。

图1 北艾水提取的总离子流色谱图

图2 北艾精油和1，8桉油精对APAP诱导的肝脏组织病理学变化

3.3 北艾精油和1，8桉油精抑制炎症相关因子的表达

与正常对照组比较，APAP处理后小鼠肝脏TNF-α、IFN-γ、CXCL-1、STAT-3、TLR-4、VCAM-1和NF-κB水平显著升高（p ＜ 0.05，图3）。经北艾精油及其主要成分1，8桉油精分别治疗后，发现基因的表达水平均较APAP模型组下降。其中TNF-α、IFN-γ和TLR-4显著下降，分别为1.59，1.78；1.95，1.68；2.55和1.92倍。

图3 北艾精油和1，8桉油精对炎症相关因子mRNA表达的影响

4 讨论

在菊科蒿属植物中，北艾具有非常重要的药用价值并且作为药物有着很长的历史[12]。本研究通过水蒸馏法提取出来的北艾精油得率为0.3%，采用GC-MS分析，鉴定出主要活性成分中1，8桉油精在北艾精油中相对百分含量为5.9%。

药物性肝损伤是引起急性肝功能衰竭的主要原因，其中APAP是最常见的诱导剂[13]。APAP过量（300mg/mL）可引起小鼠严重的肝毒性，APAP中毒时，II期偶联酶饱和，较高的部分转化为NAPQI，导致氧化应激和肝细胞坏死[14]。HE染色结果表明，APAP小鼠肝细胞出现严重的病理改变，如排列疏松、空泡变性、坏死明显（图2B），同时炎症因子以及趋化因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3CXCL-1、TLR-4、VCAM-1和NF-κB表达显著增加，表明APAP肝损伤模型构建成功。

表2 北艾精油主要成分的GC-MS分析结果

在给予北艾精油和1，8桉油精治疗后，肝脏细胞形态恢复正常，细胞坏死现象明显得到缓解（图2）。Toll样受体（Tolllike receptors，TLR）是作为连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR4能识别外源性的病原体或识别内源性物质及产物，可激发NF-κB等一系列信号通路，并且上调促炎因子、趋化因子的释放[15]。本实验结果表明APAP过量的情况下NF-κB的表达显著增加，组织中炎症因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3以及趋化因子CXCL-1和VCAM-1的表达也增加。经北艾精油及其1，8桉油精治疗后，其可下调TNF-α、TLR-4等基因的表达。说明北艾精油及其1，8桉油精可以抑制炎症因子的分泌，减少APAP引起的肝脏损伤，提示北艾精油及其1，8桉油精可能通过抑制炎症因子的表达进而缓解肝脏损伤。