支链脂肪酸iso-18:0对肝细胞脂肪沉积的抑制作用

2019-08-19贺宇佳胡睿智李柏珍刘磊伍小松

中国畜禽种业 2019年8期

贺宇佳胡睿智李柏珍刘磊伍小松*

（1，湖南农业大学动物医学院 4101281；2，湖南农业大学动物科学技术学院 410128）

支链脂肪酸（Branch-chain fatty acids，BCFA）是在直链碳链上具有一个或多个支链甲基分支的饱和脂肪酸[1]。支链甲基处于倒数第二碳原子的称为异构脂肪酸（iso），处于倒数第三碳原子的称为反异构脂肪酸（anteiso）；根据支链的数量分为单支链脂肪酸和多支链脂肪酸；根据脂肪酸的直链碳原子数量可分为奇数支链脂肪酸和偶数支链脂肪酸[2]。BCFA 在植物中含量很少，主要存在于反刍动物乳脂和人类初乳中；BCFA 也存在于人类皮肤中，在胎儿发育晚期BCFA 能占到胎儿皮脂的30%，并能为晚期胎儿发育提供营养[3]。人体中的BCFA 由支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）分解合成，反刍动物乳脂中的BCFA 主要由瘤胃细菌利用异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸合成[4]。16-甲基十七烷酸（iso-18:0）是偶数支链脂肪酸常见于人初乳和一些植物，如金鱼草和烟草植物的花瓣，是一种常见的支链脂肪酸[5]。

BCFA 在胎儿发育晚期能占胎儿皮脂的30%，分娩后在母乳中含量最高可达到1.5%，且主要存在于新生儿的肠道中，在新生婴儿的胎粪中也能检测到BCFA 的存在[3]。这意味着BCFA 在肠道的早期发育中有重要作用。将仔鼠暴露于缺氧缺血条件下构建坏死性小肠结肠炎，试验组饲喂含20%的配方奶粉，对照组饲喂不含BCFA 的配方奶粉，相比于对照组BCFA能显著降低坏死性结肠炎的发病率50%以上[6]。BCFA 还能提高初生胎儿肠道中白介素-10（interleukin-10）含量，降低早产婴儿死亡率[7]。此外，BCFA 还具有抗癌功能。BCFA 在体外试验中能诱导多种人类癌细胞系（慢性髓原白血病细胞，人乳腺癌细胞，人前列腺癌细胞，人胃癌细胞，人肝癌细胞，人典型小细胞肺癌细胞，人胰腺腺癌细胞，人结肠癌细胞）的凋亡[8]。

脂肪沉积造成的脂肪变性是引起肝脏病变的重要原因之一，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）就是典型的由肝细胞脂肪堆积诱导形成的病理症状，在我国成年人中的发病率约为 10%～24%[9]。随着经济水平提高，NAFLD 的发病率逐渐提高且呈低龄化趋势，我国青少年NAFLD 的发病率显著高于国外[10]。2 型糖尿病、肥胖、高血脂症均会引发NAFLD，主要原因是代谢紊乱造成脂肪在肝脏的过度沉积，引起肝脏损伤，导致肝脏炎症和氧化应激的产生，肝脏中甘油三脂的升高和总脂肪含量的提高是NAFLD 的直接表现[11]。在之前研究中BCFA 具有降低脂肪沉积的作用，本试验选取iso-18:0 探究其对正常肝细胞（L02）中脂肪沉积的影响，为iso-18:0 的降脂作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEMF12 培养基、胎牛血清（FBS）购自 Gibco 公司；棕榈酸、油酸、甲醛、异丙醇、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素-链霉素溶液、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS），油红O 染色试剂盒购自索莱宝公司；胎牛血清白蛋白（BSA）、iso-18:0 购自 Sigma 公司。

游离脂肪酸（FFA）：取油酸 630μL、软脂酸 256mg，溶于10ml DMSO 中，漩涡混匀，待完全溶解后为300mM，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

肝细胞系L02 细胞（购自中南大学湘雅医学院）培养于含10%胎牛血清的DMEM F12 培养基中，培养箱环境为37℃、5%CO2。根据细胞的生长情况，当细胞密度长至80%左右（7d左右），用1ml 含0.25%胰蛋白酶的EDTA 消化液消化2min，待细胞圆缩后加入0.5mlFBS 终止消化，1000rpm 离心3min。去掉上清液并加入完全培养基吹打混匀，倒置显微镜下降计数，取 1×106个进行传代培养，每 48h 换一次培养基，取第 4～7 代的L02 细胞用于试验。

1.2.2 脂肪沉积模型构建

取第 4～7 代的 L02 细胞，以 1×106个/孔的密度接种于 6 孔板，每孔加 2ml 完全培养基；每组设 3 个重复孔，于 37℃的CO2培养箱中培养；培养 24h 后，用 PBS 洗涤 2 次，正常组更换新鲜完全培养基，试验组更换含不同浓度游离脂肪酸的完全培养基，作用24h 后吸走上清液，每孔加入2ml PBS 润洗。

细胞固定：每孔加入2ml10%中性甲醛于37℃烘箱中孵育10min，之后弃掉上清液，每孔加入2ml 新鲜10%中性甲醛，并于37℃孵育90min，吸走中性甲醛，用2ml 双蒸水清洗2 次，加入1ml60%的异丙醇于37℃烘箱中孵育5min 后，弃掉上清液，让细胞在室温下自然干燥。

油红O 染色：在固定6 孔板中每孔加入1ml 配好的油红O染液并于37℃孵育30min，然后吸掉染液，立即用2ml 双蒸水洗2 次，加入60%异丙醇浸洗5min，弃去60%异丙醇后加入Mayer 苏木素染色液复染1min，然后吸掉染液，立即用2ml 双蒸水洗3 次后于电子显微镜下观察细胞内脂滴的大小及分布，并进行拍照。

1.2.3 支链脂肪酸iso-18：0 降脂作用试验设计

根据1.2.2 试验结果，将试验分为6 组，包括正常组、模型组和不同浓度iso-18:0 试验组。试验组中iso-18:0 的浓度设两个浓度梯度，分别为0.1mM 和0.25mM。取第4～7 代的 L02细胞，以 1×106 个/孔的密度接种于 6 孔板，每孔加 2ml 完全培养基；每组设3 个重复孔，于37℃的CO2培养箱中培养；培养24h 后，用 PBS 洗涤 2 次，正常组更换新鲜完全培养基，模型组和试验组更换含1.2mM FFA 和10%FBS 的完全培养基，作用24h 后吸走上清液，用PBS 洗涤2 次后，正常组和模型组更换含1%BSA 的完全培养基，试验组更换含不同浓度iso-18:0 和1%BSA 的完全培养基，培养 24h 后吸取上清，每孔加入2mlPBS 润洗，然后按照1.2.2 中油红O 染色方法进行染色。

2 结果

2.1 不同浓度FFA对L02细胞脂肪沉积的影响

由图1可知，随着游离脂肪酸浓度的增加，L02 细胞内的脂滴逐渐增多。与对照组相比，0.6mM FFA 浓度组开始出现明显脂滴但整体分布较少，0.9mM FFA 浓度组的脂滴数量明显增加，1.2mM FFA 浓度组的脂滴最多，视野内每个细胞都有明显脂滴。

2.2 支链脂肪酸iso-18：0的降脂作用

图2为不同处理组肝细胞中脂肪滴的油红O 染色结果，对照组中L02 细胞会有少量的脂滴，而用1.2mM FFA 处理过的模型组中的脂滴数量和颜色明显多于对照组，说明使用能成功1.2mM FFA 诱导的高脂L02 细胞模型。在使用0.1mM iso-18:0处理L02 细胞后脂滴的分布及数量与模型组相比并无明显变化，说明0.1mM iso-18:0 的降脂作用不明显，而使用0.25mM iso-18:0 处理的L02 细胞的脂滴数量和颜色深度明显少于模型组和0.1mM iso-18:0 组，说明0.25mM iso-18:0 的降脂效果强于0.1mM iso-18:0 浓度组。

图1 不同浓度FFA 对L02 细胞内脂滴的影响

图2 不同浓度iso-18:0 对L02 细胞内脂滴的影响

3 讨论

随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD的发病率越来越高[11]。试验模型是用于筛选药物和研究病理机制的主要方法。NAFLD 的试验模型主要是动物模型，通常选用小鼠作为试验动物，使用高脂日粮或CCl4 诱导脂肪肝模型[12]。CCl4进入体内后会引起肝脏损伤，引起肝细胞发生脂质过氧化，引起肝细胞脂肪变性[13]。采用CCl4诱导的脂肪肝模型速度快但机制和肝脏病变过程与实际人类脂肪肝的形成差异过大。而采用高脂日粮构建小鼠脂肪肝模型虽然其致病机制与实际显示但需要8～12 周时间，成本过高[12]。且动物模型对于早期药物筛选成本过高，本试验选择构建高脂L02 细胞模型。L02 细胞是人正常肝细胞系，相对于其他细胞系如肝癌细胞系HepG2，本试验选取的L02 细胞更符合实际。有研究使用DL-乙硫氨酸诱导非酒精性脂肪肝细胞模型。DL-乙硫氨酸会引起肝细胞的甘油三脂蓄积，但同时还会导致肝细胞损伤[14]。本试验选取油酸和棕榈酸按2：1 比例混合模拟人体发生代谢紊乱后血液中游离脂肪酸增多，通过不同浓度筛选发现，1.2mM FFA 浓度能使L02 细胞中脂滴含量及数量明显多于对照组。使用2:1 的油酸和棕榈酸混合物诱导，培养24h，也建立L02 肝脂肪变性细胞模型[15]。

肝脏是脂质代谢的主要场所，当脂质摄入超过肝脏的运转速度，或发生代谢会导致甘油三酯累积[11]。油红O 是很强的脂溶剂和染脂剂，较易与甘油三脂结合呈小脂滴状，通过溶剂与脂滴结合染色，因此，油红O 染色技术通常评估肝脏脂肪沉积[16]。本试验通过构建高脂L02 模型使用油红O 染色判定脂滴数量及分布，操作简单，结果明显。近年来的研究发现，支链脂肪酸能提高肠道抑炎因子含量，降低新生儿的死亡率，且还具有诱导癌细胞凋亡作用[6-8]。BCFA 对PPAR-α 具有调控作用[17]。PPAR-α 是脂肪酸代谢的关键核转录因子，所以本试验推测BCFA 具有降脂作用。iso-18:0 作为一种常见的支链脂肪酸，主要存在于母乳和一些植物如金鱼草和烟草植物的花瓣中[5]。本文选取iso-18:0，探究其对游离脂肪酸诱导的高脂L02 肝细胞模型的降脂作用。通过油红O 染色发现，0.1mM 组和0.25mM 组均能减轻L02 细胞中脂滴含量及数量，且0.25mM组效果更佳明显，说明iso-18 具有体外降脂作用。