猪流行性腹泻与猪圆环病毒2 型混合感染的诊断与分析

韩陆婵，薛翼鹏，赵 岳，孟 帆，樊振华，米瑞娟，吴 忻

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起猪腹泻的主要病毒性病原[1-2]。近几年来，国内猪流行性腹泻（PED）呈高发态势，特别是某些猪场哺乳仔猪病死率高达100%，对养猪业造成巨大损失。PED 最主要的临床症状为精神萎顿、被毛暗淡粗乱、身躯干枯、腹泻呕吐等，最终由于脱水导致仔猪很快死亡。所有日龄的猪均可感染发病，且仔猪的发病率高达100%[3]。PED 的发生存在明显的季节性，多发生于寒冷的冬季与冬春交接月份[4]；尤其出生7 d 以内的仔猪最易感病，发病早的出生后3 d 整窝暴发腹泻症状，3～4 d 后严重脱水导致死亡；3～4 周龄以上的仔猪在感染7～10 d 后可逐渐恢复；育肥猪及母猪感染后也有腹泻表现，同时也会出现嗜睡和食欲不振等表现[5]，病程一般在20 d 以上。但规模养殖场仔猪生产批次较多，病程持续的时间可能还会延长[6]。

PED 于20 世纪70 年代英国首次报道，该病迅速蔓延至欧洲各国；在亚洲，1982 在日本年首次报道PED 的发生，并迅速传播至我国、韩国等毗邻国家并不断发生流行，在20 世纪90 年代，由PED 引发仔猪的死亡率由30%上升至100%；2010 年以后，在我国南方一些省份大规模流行PED，并逐渐向内地及西北省份蔓延，据统计，至少有29 个省份存在PED 的暴发和流行；2013 年末，在韩国以及中国台湾地区也有相关PED 暴发的报道[7]。而猪圆环病毒2 型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）是我国目前猪感染率最高的疫病，可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），其可造成免疫抑制，临床上亦可表现腹泻[1-2]。这2 种病混合感染，会导致病情加重，死亡率加大，给疫病的及时确诊和防控带来了难度。目前有报道指出，2 种病毒同时感染引发的疾病已经给世界养猪业造成了巨大的经济损失[1，8]。

2015 年以来山西省多个地区规模化猪场哺乳仔猪发生水样腹泻，最终脱水导致死亡，死亡率高达80%～100%，损失严重，到目前为止仍有猪场未得到控制。主要表现7 日龄内哺乳仔猪整窝暴发腹泻、呕吐、脱水等临床症状，且死亡率极高；同时育肥猪以及成年母猪也出现腹泻或精神沉郁。

山西省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室从各地规模化猪场采集因腹泻病死哺乳仔猪肠道内容物及肠系膜淋巴结各53 份，对其进行了分子学检测诊断，旨在明确引发PED 的主要病原，并提出了相应的综合防控措施，为PED 的有效防控提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 严格按照动物疫病实验室病料样品采集方法的相关规定，对山西省5 个哺乳仔猪流行腹泻的规模化猪场采集病、死猪，实验室无菌条件下将肠内容物及3 个不同位置的肠系膜淋巴结取样53 份，-70 ℃保存备用。

1.1.2 PCR 试剂盒 猪圆环病毒PCR 检测试剂盒和猪流行性腹泻病毒RT-PCR 检测试剂盒由北京世纪元亨提供。

1.2 方法

1.2.1 组织样品处理 取肠系膜淋巴结约1 g，用手术剪剪碎后取0.05 g 于研磨器中加入PBS 缓冲液1.5 mL，研磨至匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，以8 000 r/min 离心2 min，取上清液100 μL 移至1.5 mL 灭菌离心管中。

1.2.2 肠内容物样品处理 取约0.05 g 肠内容物置于1.5 mL 灭菌离心管中，再加入PBS 缓冲液1 mL 振荡30 s，以8 000 r/min 离心2 min，取上清液100 μL转入1.5 mL 灭菌离心管中。

1.2.3 PEDV 检测 将肠内容物样品置于吸附柱中，以13 000 r/min 离心30 s。弃去收集管中离出液体，加入600 μL 洗液，重复离心2 次。弃去收集管中离出液体，13 000 r/min 空柱离心2 min，除去残留的洗涤液。将吸附柱换入新的1.5 mL 离心管中，加入洗脱液50 μL，室温静置1 min，重复离心30 s，离心管中获取PEDV 模板RNA。RT-PCR 扩增每份总体积20 μL，进行PCR 扩增：42 ℃45 min，95 ℃3 min；95 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃40 s，共35 次循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 产物及其相应的阳性对照在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察被检样品出现651 bp 为阳性。

1.2.4 PCV2 检测 将淋巴结样品100 μL 移入1.5 mL灭菌离心管中，加入20 μL蛋白酶K 和200 μL消化液，振荡30 s 混匀后，置56 ℃电浴器中消化60 min。降至室温后，加入300 μLDNA 结合液，充分混匀，移入吸附柱中，室温下静置3 min，以10 000 r/min 离心30 s。弃去收集管中液体，加入500 μLDNA洗涤液，重复离心2 次。弃去液体，将吸附柱换入新的1.5 mL 离心管中，加入50 μL DNA 洗脱液，室温下静置2 min，再次离心30 s，获得液体即为PCV2模板DNA。PCR 扩增每份总体积20 μL，进行PCR扩增：94 ℃3 min；94 ℃30 s，62 ℃45 s，72 ℃45 s，共35 次循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 产物及其相应的阳性对照在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察被检样品出现1 154 bp 扩增带为PCV2阳性。

2 结果与分析

2.1 PEDV 检测结果

电泳结果显示，肠内容物样品53 份中有48 份在651 bp 处出现阳性条带，与PEDV 阳性对照出现条带位置一致。样品PEDV 阳性率为90.6%（图1）。因此，可以判定山西省多地区规模化猪场新生仔猪发生水样腹泻导致大批死亡的主要病原是PEDV，临床症状表现与PED 一致。该病的主要传染源是发病猪和带毒猪，康复猪会持续带毒，并不断排出带有PEDV 的粪便，污染环境和饲料；PEDV 的传播途径是通过口与鼻进入猪的体内[9]，除有效的疫苗预防外，也应搞好综合防控措施。

2.2 PCV2 检测结果

电泳结果显示，在肠系膜淋巴结样品53 份中有37 份在1 154 bp 处出现阳性条带，与PCV2 阳性对照出现条带位置一致。样品PCV2 阳性率为69.8%（图2）。本次发病猪群的临床症状不仅表现为腹泻，还有精神沉郁、行动迟缓、厌食、被毛蓬乱、皮肤苍白、呼吸困难和以间断性咳嗽为特征的呼吸症候。说明在本次PED 的大面积流行是由PEDV与PCV2 混合感染引起的。所以，在预防PED 发生的同时，也应搞好PCV2 的预防工作。

3 结论与讨论

本研究通过对腹泻死亡仔猪肠道内容物及肠系膜淋巴结的检测可以认定，本次山西省多地区规模化猪场大面积出现新生仔猪发生水样腹泻导致大批死亡的主要病原是PEDV，并且伴随着PCV2 的混合感染。发病猪场通过对母猪和仔猪进行PEDV疫苗的免疫[10-11]，在产前30 d 对母猪加强免疫PCV2疫苗，并对猪舍及产房采取严格消毒、注意保温与空气流通、保证仔猪出生后6 h 之内吃到初乳等措施后，使猪群发病情况明显下降。

2010 年以来，在我国南方一些省份大规模流行PED，并逐渐向国内其他省份蔓延，经研究证实，PEDV 流行株发生变异[12-14]，当前疫苗株不能提供良好的保护[7，12，15-16]。因此，PED 在山西省的严重发生与其在我国的流行具有很大关系[15]，不仅有病毒发生变异的原因，而且与PCV2 的协同感染致使猪群的发病率、死亡率增加有着很大的关系。PCV2 感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原[17]，其与PEDV 等病毒以及细菌混合感染的情况多有报道[1，8]，可使猪群病死率大大提高。资料显示，PCV2 的首次发现也在20 世纪90 年代，此时正是PED 在世界各国呈现高发病率、高死亡率的时期[1-2]。因此，在当时PED 流行高发可能与PCV2 在猪群中感染情况增加具有一定关系。本次检测发现，7 日龄之内的哺乳猪PCV2 病原阳性率为69.8%，说明猪群存在早期感染或母乳中母源抗体水平低下，所以，猪群疫病防控过程中应当把PCV2的免疫防疫作为首要工作。在产前免疫PEDV 疫苗的同时，也应加强PCV2 疫苗的免疫，以免仔猪过早感染PCV2，引起免疫抑制和PED 的发生。同时，预防PCV2 的早期感染对提高生产性能和控制其他疫病继发感染同样具有非常重要的意义。