反复植入失败与子宫内膜容受性标志物研究进展

牛凯迪，王春雪，于月新

(北部战区总医院和平分院生殖医学中心，沈阳 110003)

反复植入失败(RIF)的原因包括母体因素和胚胎因素，母体因素所致RIF占绝大部分，包括子宫内膜病理、激素或代谢紊乱、免疫因素等，其中子宫内膜容受性异常是植入失败的主要原因。成功胚胎植入的前提首先是类固醇激素和细胞因子调节子宫内膜的血管通透性，然后将特定的免疫细胞群招募到植入部位[1]，中间任何一个环节出现差错就会导致胚胎植入失败。通过研究反复植入失败的分子机制，为进一步提高子宫内膜容受性找到解决办法，有利于胚胎植入。本文主要针对RIF和子宫内膜容受性相关因子如粘附因子、非编码RNA和免疫细胞进行综述。

一、粘附因子与子宫内膜容受性

1.血小板内皮细胞粘附因子(PECAM1)：PECAM1位于子宫内膜组织的上皮细胞和基质细胞。PECAM1和同源框基因A10(HOXA10)一样，蛋白表达水平在增殖后期开始增加，分泌中期达到峰值[2]，进一步证实PECAM1可以作为子宫内膜容受性的生物标志物。研究发现RIF组PECAM1 mRNA和蛋白水平明显低于对照组[2]；PECAM1通过其下游转化生长因子β1(TGFβ1)调控子宫内膜，影响胚胎植入，可用于开发RIF潜在治疗方法。

2.Krüppel样因子12(KLF12)：KLF12属于KLF家族中锌指转录因子，是由孕酮控制的下游基因[3]，可以负调节子宫内膜蜕膜化[4]。RIF可能与KLF12相关，Zhang等[5]发现分泌中期RIF患者子宫内膜样本中异常表达KLF12。KLF12还可以抑制体外培养的Ishikawa细胞(高分化子宫内膜腺癌细胞系)白血病抑制因子(LIF)的表达，在人类子宫内膜发现了类似反应，KLF12可能通过抑制LIF来降低胚胎的粘附能力[3]。用人重组的LIF治疗富含KLF12的Ishikawa细胞，可以提高胚胎粘附率[3]，降低KLF12是否会提高胚胎移植成功率有待进一步研究。

3.黏蛋白1(MUC1)：MUC1在管腔和腺上皮高度表达，可以抑制囊胚植入附着期起重要作用的黏附因子的表达。在植入窗口期，MUC1降低到相对较低的水平，进而使得胚胎和子宫内膜相容受。而在RIF女性中，MUC1水平极低。研究也证实了在RIF患者血液和子宫内膜中MUC1含量显著低于有生育能力的对照组女性[6]。子宫内膜MUC1表达是选择和植入活性高、质量好的囊胚所必需的[7]。因此，MUC1的大幅度减少可能破坏子宫内膜的胚胎选择，无法维持正常妊娠。MUC1作为一种免疫调节剂来防御外来物质并保护植入胚胎[8]，其含量极度减少降低了这种保护作用，使胚胎易受攻击。MUC1不受人口学和临床特征影响，是一项独立检测子宫内膜容受性的标志[9]。由于MUC1在内膜组织和血液中有高度相关性，因此可以通过无创检测外周血MUC1的表达来评估子宫内膜容受性[6]。

二、非编码RNA与子宫内膜容受性

随着微阵列和高通量测序的出现，表观遗传对子宫内膜容受性的调控更多地得到了证实[10]。检测子宫内膜RNA水平，可评估进而提高子宫内膜容受性。

1.长链非编码RNA(lncRNA)：lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA几乎参与人类生物学所有方面，从染色质结构、修饰、转录、翻译，到细胞分化、细胞结构完整性、细胞周期调控等方面[11]，它通过激活基因增强子和修饰染色质复合物来控制基因表达。由于lncRNA对子宫内膜作用还不明确，只能通过与mRNA共表达来间接推断其功能。lncRNA及其蛋白编码共表达基因聚集在数百条通路上，其中一些是调节子宫内膜容受性的关键通路，如Toll样受体(TLR)信号通路和B细胞抗原受体(BCR)信号通路。因此，这些lncRNA大多数被预测参与多种途径，在子宫内膜容受性上发挥着重要作用。对分泌中期子宫内膜进行微阵列研究，可以得到RIF患者和对照组相应的lncRNA[10]，并进行个性化子宫内膜容受性诊断。由于一些lncRNA在外周血中保持稳定，并受到内源性核糖核酸酶保护，因此可以作为诊断和检测的生物标志物[12]。

2.微小核糖核酸(microRNA)：microRNA是具有20到30个核苷酸的内源性非编码RNA[13]，它能靶向阻断mRNA翻译或选择mRNA进行降解，抑制转录后基因表达[14]，进而调节细胞发育及表观遗传。在子宫内膜的周期性变化情况下，多种microRNA调控上皮细胞的增殖和分化，从而调节子宫内膜容受性[15]。通过微阵列检测RIF患者和对照组差异表达的microRNA，进一步得到靶基因和通路，从而进行相应靶点治疗。miR-145可以降低子宫内膜上皮的胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)蛋白水平，减少胚胎粘附，RIF患者miR-145含量明显高于对照组，子宫内膜miR-145抑制疗法可能会提高RIF患者的移植率[16]。

3.环状RNA：环状RNA是一种特殊类型的内源性非编码RNA，属于共价闭环，有较高的稳定性和组织特异性，比其他RNA更适合作为生物标志物[17]。环状RNA以microRNA为靶点调控基因表达进而发挥其功能。用基因芯片检测RIF患者和有生育能力的女性，发现在RIF患者中有7个环状RNA上调[18]。但目前环状RNA如何在子宫内膜容受性中发挥作用仍在研究中。

三、基因多态性与子宫内膜容受性

基因多态性经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，它的发生可能是由于基因组中重复拷贝数的不同，也可能是单拷贝序列的变异，或者等位基因的转换或替换。

1.亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)：MTHFR基因位于1号染色体的短臂上，由11个外显子组成，对细胞分裂、胚胎发育和早期妊娠有重要作用。MTHFR基因最常见的两种多态性MTHFR 1298A>C(rs18001131)和MTHFR 677C>T(rs18001133)[19]，可以作为评估胚胎能力的新生物标志物，增加筛选出可以妊娠的胚胎的可能性[20]。母体血管血栓的形成，可能会减少绒毛间隙的灌注，导致胎盘形成失败，MTHFR纯合或杂合基因突变导致酶活性降低，同型半胱氨酸累积[21]，更容易发生血栓。MTHFR是叶酸代谢的重要酶，可以通过母体膳食的补充来支持依赖MTHFR的细胞通路，甚至可以在进行辅助生殖技术的胚胎培养基加入叶酸[20]，这可能促进胚胎植入，减少RIF发生。

2.核因子κB(NF-κB)多态性：NF-κB调节细胞生理学许多方面如免疫、炎症、细胞生存等[22]。NF-κB1和NF-κB p65是NF-κB的两个关键二聚体。NF-κB1 94ins/del AGGT(rs2836249)是唯一已知功能的基因多态性，研究发现与健康对照组相比，RIF患者携带rs2836249缺失的等位基因频率更高(P<0.01)[23]。NF-κB蛋白质表达障碍可能造成子宫内膜容受性降低，进而导致RIF。

四、免疫细胞与子宫内膜容受性

免疫细胞在子宫内膜容受性发挥着重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡，这其中调控的关键元件是树突细胞和调节T细胞[24]。

1.调节T细胞(regulatory T cells，Tregs)：胚胎植入和肿瘤发生在行为和机制上有很多相似之处，调节T细胞作为抗肿瘤免疫应答的主要抑制因子，对肿瘤血管生成有重要的直接作用[25]，推测其能影响子宫内膜容受性。

调节T细胞广泛分布在外周血循环和组织中，趋化因子-趋化因子受体诱导的细胞控制着它们的分布。叉头状转录因子(forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3)被认为是调节性T细胞的标志性分子。Diao等[26]的研究显示，与对照组相比，RIF患者内膜Foxp3+Tregs显著降低；用流式细胞术分析了外周foxp3+T细胞的趋化因子受体3(CXCR3)、趋化因子CC类受体4(CCR4)、趋化因子CC类受体6(CCR6)和趋化因子CC类受体7(CCR7)的表达，在对照组和RIF组中CXCR3、CCR6、CCR7表达无显著差异，CCR4表达有显著差异，这一结果表明，有RIF女性外周Tregs细胞的趋化倾向发生了改变。

CD4+CD25+T细胞是自然存在的调节T细胞，在维持机体对自身抗原耐受中扮演重要角色。小鼠相关研究中发现调节T细胞抑制了雄性特异性组织相容性(male specific minor histocompatibility，H-Y)抗原对胎儿的母体免疫反应[27]，而在人类的研究中又发现正常妊娠与循环淋巴细胞群中CD4+T细胞、CD25+T细胞数量增加有关。此外，体外受精-胚胎移植患者外周血中高比例Tregs与更好的妊娠结局呈正相关。

2.免疫相关因子和子宫自然杀伤细胞：肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导因子(tumor necrosis factor-like apoptosis weak inducible factor，TWEAK)是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的细胞因子，由多种白细胞(单核细胞、树突状细胞、子宫自然杀伤细胞等)组成，TWEAK与成纤维细胞因子诱导基因(fibroblast factor inducible gene，Fn14)受体结合可以防止局部细胞毒性，促进人子宫内膜血管生成及构建免疫营养通路[24]。子宫内膜在着床期时局部免疫由Th1转变成Th2，在此期间65%～70%的免疫细胞为自然杀伤(NK)细胞，其标志物为CD56。子宫NK细胞在正常情况下不会自发产生细胞毒性，在高Th1环境下，NK细胞对滋养细胞侵袭有杀伤毒性[28]。

RIF患者体内NK细胞数量异常，并且白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)等细胞因子表达失调。IL-15促进Tregs和NK细胞增殖。IL-18属于前炎症因子，研究中表明着床是炎症过程，其特征是大量的生长因子和细胞因子分泌[29]。IL-15、IL-18共同促进Th2生成，下调炎症和细胞毒性通路，进而影响螺旋动脉蜕膜化[28]。然而，过高的IL-15、IL-18会使Th2细胞转变为Th1细胞，引起RIF免疫过度激活，同样不利于胚胎植入。通过测量IL-18/TWEAK mRNA比率来记录局部细胞毒性/血管生成平衡，IL-15/Fn-14 mRNA比率用于评估子宫NK细胞的活化和成熟状态，而CD56+细胞计数同时测量它们在子宫内膜的相对含量[28]。植入前测量IL-15、IL-18、CD56可以方便制定下一步治疗方案，进而对患者进行个性化胚胎移植，糖皮质激素治疗子宫内膜过度激活，而黄体支持和子宫内膜局部损伤相关治疗策略适合治疗子宫内膜活化低的女性[28]。

五、总结

子宫内膜容受性是一个复杂过程，涉及到多种细胞因子、粘附因子、母体基因多态性及免疫状况等方面。胚胎植入成功需要足够的母体免疫诱导微环境，来保护半异基因胎儿免受母体免疫排斥[30]。子宫内膜因子和母体基因多态性可以作为潜在的生物标志物，来判断子宫内膜容受性状况，并进行下一步的相应治疗。本文只是列举了几个与RIF相关的因子，仍有许多因子未发现或正在研究。