YY1对卵巢癌细胞增殖和侵袭作用影响及其分子机制

加秋萍，梁婉琪，李芬霞，张美，赵宗霞

(西安医学院第二附属医院妇产科，西安 710032)

卵巢癌是女性常见的生殖器官恶性肿瘤之一。卵巢癌的发病率及死亡率均位于我国女性生殖器官恶性肿瘤的前五名[1-2]。卵巢癌恶性程度高，极易在盆腹腔扩散转移，预后差，5年生存率低于50%[3-4]。Yin Yang 1(YY1)是一个参与了多种恶性肿瘤转移的癌基因[5]。人源YY1由414个氨基酸组成，是属于一种锌指蛋白类同时具有复杂功能的转录因子，YY1可将组蛋白脱乙酰酶和组蛋白乙酰转移酶直接导入启动子以激活或抑制启动子，可以同时促进和抑制相应的基因转录。国内外研究表明YY1在具有转移和侵袭性的肿瘤如前列腺癌、肺癌、结肠癌中高表达[6]，其过量表达与肿瘤的临床病理分期和转移有密切的联系。上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是早期肿瘤转化为具有高侵袭性和高转移性的主要机制，主要由于上皮特性的丧失和间质特性的转换，促进了肿瘤的侵袭性[7]。研究表明，在胃癌中EMT的发生可以促进肿瘤侵袭和转移[8]，越来越多的研究将YY1和EMT之间的相互作用作为重要研究方向。本研究采用卵巢癌患者肿瘤组织和卵巢癌细胞系HO8910PM，探讨YY1是否通过促进EMT相关蛋白表达从而对卵巢癌形成转移产生影响。

材料和方法

一、研究对象

本研究共纳入本院2017年10月至2018年5月收治的85例卵巢癌患者，年龄29～63岁，平均(49.35±6.63)岁；依据国际妇产科联盟(FIGO)分期标准：Ⅲ期68例，Ⅳ期17例；病理分型：上皮型恶性肿瘤63例(黏液型6例，浆液型48例，透明细胞肿瘤4例，子宫内膜样肿瘤3例，移行细胞肿瘤2例)，非上皮型恶性肿瘤22例。所有卵巢癌患者均经过病理检验科诊断证实，所有患者取材时尚未经过任何治疗。实验方法和目的均告知患者和家属，并签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会批准。

二、研究方法

1.主要试剂和仪器：卵巢癌细胞系HO8910PM(中科院上海细胞库)；胎牛血清(Gibcom，美国)，RPMI 1640培养液、0.25%胰蛋白酶(Thermo Fisher，美国)；Trans-well小室(Costar，美国)；Matrigel生物胶(BD，美国)；YY1引物、反转录试剂盒(Takara，日本)；Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，美国)；Hoechst 染料(Sigma，美国)；4%多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术)；结晶紫(西安国安生物科技)。

2.细胞培养：卵巢癌细胞系HO8910PM采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，取指数生长期细胞进行实验。

3.细胞转染：用0.25%的胰蛋白酶消化指数生长期细胞，将细胞悬液接种于6孔板中，每孔接种的细胞数约5×105个，培养过夜，待细胞贴壁即可进行转染。按照Lipofectamine 2000 Reagent 转染试剂盒说明书上的实验步骤，将50 pmol的YY1小干扰RNA(small interfere RNA，siRNA)和50 pmol的YY1阴性对照(negative control，NC)转染到HO8910PM细胞中，4～6 h后更换培养液，48 h后提取RNA，RT-PCR检测转染后细胞中YY1的表达变化，并收集细胞进行后续实验。

4.实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)：提取总RNA，定量后，反转录成cDNA，qRT-PCR检测YY1的表达情况，以GAPDH作为内参，采用2-△△CT法进行相对定量分析。qRT-PCR 反应条件为：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。YY1引物序列(5’-3’)：正向TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT；反向GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT。

5.细胞增殖实验：将细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板，设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱内培养24 h、48 h和72 h，培养结束后每孔加入20 μl的CCK-8，再在培养箱内孵育3 h，室温条件下于摇床震荡10 min，酶标仪490 nm波长测OD 值。

6.Trans-well细胞侵袭实验：配制BD胶和培养液(1：9)，冰上操作，然后在 37℃细胞培养箱孵育5 h，在 37℃细胞培养箱水化基底膜 30 min。胰蛋白酶消化指数生长期细胞，计数，无血清DMEM培养液调整细胞数为5×104/孔，Trans-well 小室下室加入正常10% 胎牛血清DMEM 培养液600 μl，接种200 μl无血清细胞悬液于24孔 Trans-well小室上室，设3个复孔。16 h后PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室温风干。0.1%结晶紫染色15 min，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞，33%乙酸脱色，570 nm读数。

7.Western blot：将浓度1×106/ml的细胞接种于6孔板中，设3个复孔。细胞贴壁取出6孔板，弃掉上清；PBS清洗1 min后加含有蛋白酶抑制剂的裂解液并吹打细胞团，后放置冰上裂解，30 min后用细胞刮将细胞刮下来转移至1.5 ml试管中，高速离心并抽取上清，即为所提蛋白。取患者肿瘤组织液氮冷冻，随后进行碾磨，裂解液裂解，低温离心取上清，即为组织蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min，样品可冻于-80℃保存。SDS-PAGE电泳后进行转膜操作，转膜成功后用脱脂牛奶进行封闭，PBS清洗，裁剪条带并分别加入相应抗体，均为1：1 000稀释，室温孵育1 h后4℃过夜。次日反复清洗条带，加二抗室温孵育90 min，PBS反复冲洗，然后加ECL发光液，化学发光仪检测并拍照。

三、统计学分析

结 果

一、YY1在卵巢癌、癌旁组织和正常组织的表达

收集卵巢癌患者手术样本，采用qRT-PCR和Western Blot分析YY1在癌组织(OCT)、癌旁组织(PT)和正常组织(NT)中的表达情况，结果显示，YY1在卵巢癌组织中的表达显著高于癌旁组织和正常组织(P<0.01)(图1)。

A：qRT-PCR检测YY1 mRNA的表达；B：Western Blot检测YY1蛋白的表达与其他两组比较，*P<0.01；与NT组比较，#P<0.05图1 YY1在卵巢癌、癌旁组织和正常组织的表达

二、干扰RNA瞬转技术降低YY1在细胞中的表达

首先检测了4种人卵巢癌细胞系(SKOV3、OVCAR-3、HO8910PM、A2780)中YY1的表达情况，结果发现YY1在HO8910PM细胞系表达最高(图2A)；其次利用YY1干扰RNA及其对照转染细胞系HO8910PM构建YY1低表达细胞系(HO8910PM-si)和对照细胞系(HO8910PM-NC)。qRT-PCR检测转染后YY1在mRNA水平表达情况(如图2B)，结果显示在卵巢癌细胞系HO8910PM中转染干扰RNA后，YY1的表达水平下调，具有显著性差异(P<0.05)。

三、 YY1下调后对HO8910PM细胞增殖作用影响

CCK-8试验结果显示，降低卵巢癌细胞YY1表达，干扰组的增殖细胞数显著低于NC组，说明降低YY1的表达可以显著抑制卵巢癌HO8910PM的增殖能力(P<0.01)(图3)。

A：4种卵巢癌细胞中YY 1蛋白表达；B：YY1干扰RNA瞬转转染后HO8910PM细胞中YY 1 mRNA表达与其他组比较，*P<0.05图2 YY1在不同肿瘤细胞系中表达情况

相互比较，*P<0.05，#P<0.01图3 YY1表达下调对HO8910PM细胞增殖能力的影响

四、YY1下调对HO8910PM细胞侵袭能力的影响

Trans-well侵袭实验结果显示，YY1干扰组的细胞侵袭能力显著低于NC组，说明降低YY1的表达可以显著抑制卵巢癌HO8910PM细胞的侵袭能力(P<0.01)(图4)。

五、YY1下调后对HO8910PM细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响

Western blot检测结果显示，YY1干扰HO8910PM细胞与NC组相比，E-cadherin表达增高而N-cadherin和Vimentin表达显著降低(P<0.05)(图5)。

相互比较，*P<0.01图4 YY1表达下调对HO8910PM细胞侵袭能力的影响

相互比较，*P<0.05图5 YY1表达下调对HO8910PM细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响

讨 论

卵巢癌已经成为世界上发病率及死亡率仅次于宫颈癌的女性生殖器官恶性肿瘤，其恶性程度高，转移率高，临床治疗效果极差，5年生存率远低于其它肿瘤。因此，发现新的靶分子可以为提高卵巢癌治疗及预后提供更好的研究方向。EMT在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用，越来越多的研究将EMT作为卵巢癌转移的重要研究方向。E-cadherin和Vimentin作为EMT的关键分子可能受多种机制调控，如转录因子、mirRNA等[7-8]。因此针对EMT的深入研究，对于揭示卵巢癌转移的分子机制和肿瘤的治疗具有重要意义。

国内外研究发现YY1可以参与多种肿瘤的转移调控[9-11]。YY1既可以通过靶向lncRNAPVT1调节肺癌的恶性病变[12-15]，也可以通过与RING1的相互作用抑制乳腺癌的增殖和转移[16-17]。Khachigian[18]则提出YY1可以作为肿瘤治疗的一个新兴靶点。以上结果均提示YY1在肿瘤的形成、发展及肿瘤细胞的增殖中可能发挥重要作用，可能作为肿瘤治疗的潜在靶点。

本研究为了验证YY1在卵巢癌细胞转移中发挥的作用，首先通过查阅数据库分析YY1在多种恶性肿瘤中表达趋势，结果显示YY1在多种具有高转移性的肿瘤如胃癌、结肠癌等高表达。通过qRT-PCR和Western Blot检测85例卵巢癌患者肿瘤组织与癌旁正常组织中YY1的表达，发现YY1在卵巢癌组织中的表达显著高于癌旁组织。为了进一步分析YY1在卵巢癌中的作用，采用siRNA干扰技术下调YY1在卵巢癌细胞系HO8910PM中的表达，qRT-PCR检测干扰前后细胞系YY1的表达，结果表明YY1在mRNA水平表达被显著降低，说明成功利用siRNA构建了YY1敲减细胞系。通过增殖、侵袭和转移等功能实验验证下调YY1表达后的卵巢癌细胞的恶性生物学行为，发现卵巢癌细胞系增殖、转移及侵袭能力显著下调。同时通过验证YY1与EMT相关分子的表达，发现YY1可以通过促进上皮间质转化相关蛋白N-cadherin和Vimentin表达、抑制E-cadherin的表达来激活卵巢癌细胞EMT的发生。

通过研究结果，本研究认为YY1与卵巢癌转移和侵袭密切相关。同时实验数据提示，YY1可能在卵巢癌进展中具有调节EMT的重要作用，有望成为卵巢癌的治疗靶点。在临床上，这些实验结论有望为YY1靶向基因治疗卵巢癌提供部分依据。