葫芦巴丸加减方对子宫内膜异位症大鼠相关神经生长因子的影响

王乾平 ，王铁枫 ，刘雁峰 ★

（1.中日友好医院 中医妇科，北京 100029；2.北京中医药大学 东直门医院 妇科，北京 100700）

子宫内膜异位症（endometriosis，ENT）以下简称内异症，是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆内膜以外的身体其他部位而引起的，以进行性痛经、性交痛、不孕、月经异常等为主要症状的疾病。它是育龄妇女的多发病、常见病。

内异症在中医学属 “痛经”、“癥瘕”、“月经不调”、“不孕”等范畴。北京中医药大学东直门医院肖承悰教授在多年的临床实践中总结出 “阳气不足，寒凝血瘀”是本病的重要病机之一，因此主张临床治疗内异症时应温通并重，扶正与祛瘀并举。肖老选用宋代《太平惠民和剂局方》所载葫芦巴丸为基础方随症加减治疗内异症，取得了良好的临床疗效。本研究通过建立内异症大鼠模型，观察葫芦巴丸加减方对相关神经生长因子表达的影响，探讨内异症神经源性相关的发病机制。

1 材料

1.1 实验动物

选择 7～8周龄无病原体级（specificpathogen，SPF）雌性 SD大鼠54只，性成熟，未经交配生育，体重200±10g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。实验动物饲养于中日友好医院生物安全Ⅱ级实验室，室温 25±1℃，相对湿度 50%～60%，光照明暗各12h，自由摄食水。

1.2 主要药品和试剂

葫芦巴丸加减方颗粒剂，具体药物组成：葫芦巴、巴戟天、吴茱萸、小茴香、郁金、片姜黄、莪术、王不留行等。购自北京中医药大学东直门医院草药房。

对照药物为孕三烯酮（内美通，2.5mg/粒），购自北京中医药大学东直门医院西药房。产品批号：531604011。将孕三烯酮（内美通，2.5mg/粒）溶于50ml的温蒸馏水中，玻璃棒搅拌混匀，浓度为0.05g/ml，置于4℃冰箱备用。

主要试剂：乙醇、二甲苯、磷酸盐缓冲液（PBS）、3%双氧水、 中性树胶、DAB显色试剂、兔超敏二步法免疫组化试剂盒（北京中山金桥生物科技有限公司）、一抗大鼠NGF、trkA、p75 NTR单克隆抗体（英国Abcam公司）。

1.3 主要仪器和设备

石蜡切片机、脱水机、展片机（德国LEICA公司），生物组织包埋机（孝感宏业医用器械有限公司），微波炉（广州美的有限公司），-80℃冰箱（美国Thermo公司）。

2 方法

2.1 分组

按照随机表法，共分为6组，分别为假手术组、空白模型组、阳性药物对照组（孕三烯酮组）、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组9只大鼠。除假手术组外，其余5组均按照自体移植方法建立大鼠子宫内膜异位症模型。

2.2 动物造模

采用自体移植法进行造模[1]：适应性喂养1周，阴道涂片观察，连续2个以上的规律动情周期后开始造模。造模前24h给造模组大鼠戊酸雌二醇0.2mg/只灌胃以诱导大鼠发情，开腹剪取大鼠右侧子宫角约1cm长的一段，迅速置于盛有0.9%生理盐水的培养皿中，将子宫断端行端端缝合。从剪下的子宫段切取1.0cm×0.5cm大小的一块，以内膜面贴向左侧腹膜血管丰富处，缝合四角，关腹。术后常规抗感染处理。4周后模型复制成功。

2.3 给药

各组大鼠造模后4周进行灌胃，假手术组和空白模型组每日灌服生理盐水10ml/kg；中药低、中、高剂量组大鼠每日分别按4.4g/kg、8.8g/kg、17.6g/kg生药量灌服葫芦巴丸加减方；西药组灌服孕三烯酮混悬液0.25mg/kg，2次/周，其余时间灌服等量生理盐水。各组大鼠每日固定时间给药，连续4周。

给药剂量根据“千克体重剂量换算公式”[2]计算：Db=Da·Rab；Rab=（ka/kb）·（wa/wb）/3。

因此，小鼠等剂量的给药量为临床成人用药量 6 倍。中药剂量（中剂量组）按 8.8g/（kg·d）给药。孕三烯酮组按 0.25mg/（kg·d）给药；模型组及正常组予生理盐水灌胃，连续给药4周，进行相关指标检测。

2.4 标本制备

给药治疗4周即最后1次灌胃结束后次日，麻醉大鼠进行剖腹以获取子宫内膜异位组织。将大鼠置于冰上，剪取大鼠腹壁处形成囊泡的子宫内膜异位组织，放入4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化检测。

2.5 免疫组化法检测样本

采用免疫组化法检测在位和异位内膜中神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、络氨酸激酶（tyrosinekinase，trkA）、p75神经营养素受体（p75neurotrophin receptor，P75NTR）指标的表达。将样本石蜡固定，纵切为厚度约5um的切片，然后进行免疫组化染色。具体石蜡切片流程如下：梯度酒精脱水、二甲苯浸泡、石蜡浸泡、石蜡包埋、切片、烤片。二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10min，100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、超纯水各5min脱蜡。柠檬酸盐抗原修复，H2O2封闭，血清封闭，加一抗、滴PBS稀释（NGF、trkA、P75 NTR的稀释比例均为1:100），4℃孵育过夜；次日甩干后二抗孵育，DAB显色，苏木素染核，酒精盐酸分色，脱水封片。最后，光学显微镜下拍片，Image-pro软件计算染色结果，检测图像积分光密度（IOD值），比较免疫组化的强弱。

2.6 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较若符合正态分布，采用单因素方差分析（One Way ANOVA），组间两两比较若方差齐，采用Tukey-Kramer方法，若方差不齐，采用Games-Howell法。

3 结果

3.1 葫芦巴加减方对内异症大鼠NGF蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组和各药物组NGF的表达量均增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，西药组和中药各组均明显降低（P＜0.01）；中药各组比较，中药组中剂量组NGF表达最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明，中药可以有效降低异位内膜NGF蛋白表达水平。见表1、图1（封底）。

3.2 葫芦巴加减方对内异症大鼠trkA相对蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组和各药物组trkA的表达量均增高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组和中药各组均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；中药各组之间比较，无明显差异（P＞0.05）。见表1、图2（封底）。

3.3 葫芦巴加减方对内异症大鼠 p75 NTR相对蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组和各药物组P75 NTR 的表达量均增高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组和中药各组均明显降低，差异有统计意义（P＜0.01）；中药各组比较，中药组中剂量组P75 NTR 表达最低（P＜0.05）。结果说明，中药可以有效降低异位内膜P75 NTR蛋白表达水平。结果见表1、图3（封底）。

4 讨论

内异症病因复杂，始终是国内外妇科领域研究热点，Sampson提出经典的“经血逆流”学说以后，在位内膜决定论、体腔上皮化生、血管及淋巴转移学说以及干细胞理论等其发病相关的因素也陆续被提出，同时，相关基因的表达和调控异常、免疫炎症反应以及性激素受体表达异常等与内异症的发生也密切相关。而引起内异症复杂的疼痛症状则与病变类型及部位有关，深部浸润型内异症疼痛程度最重，其疼痛的发生主要与神经解剖机制、雌激素高敏感性、盆腔炎性因子的影响等因素有关。目前，神经解剖机制是内异症疼痛发病机制中最热门的研究领域[3～5]。

内异症患者体内存在神经纤维的异常分布，分布密度与患者的疼痛严重程度密切相关，且内异症患者病灶内的高神经纤维分布与其神经因子高表达相伴出现[6，7]。Arnold等[8]报道内异症腹膜病灶中交感神经纤维密度降低而感觉神经纤维密度增加，两种神经纤维的比例失衡，可能与内异症疼痛的发生有关。内异症患者病灶内的高神经纤维分布与其神经营养因子（neurotrophin，NT）高表达相伴出现。

国内目前对NGF及其受体与子宫腺肌病痛经关系有初步探讨。有研究表明，神经生长因子通过其受体介导，可提高神经纤维的敏感性和雌激素受体的表达，引起子宫收缩和对疼痛的敏感[9]。有实验表明TrkA在子宫腺肌病痛经患者异位内膜及在位内膜中广泛表达，在子宫腺肌病发病及痛经的发生中起重要作用，该实验认为子宫腺肌病痛经的发生与子宫内膜NGF表达增加有关[10]。李晓燕等[11]对腹腔镜术后28例内异症患者及10例非内异症患者进行临床观察，发现P75NTR可能参与内异症的发病，NGF及其受体P75 NTR在在位内膜中的表达与疼痛相关，表明其可能参与了内异症疼痛发病机制。研究表明NGF和其受体trkA和P75NTR在子宫内膜异位症患者中的表达和盆腔疼痛密切相关。而其中NGF的表达强度和血清中雌激素浓度密切相关[12]。同时，孕激素能够拮抗雌激素作用，从而抑制NGF表达[13]。另有研究说明，孕激素可以减弱异位内膜中trkA和P75NTR的表达[14]。孕三烯酮为孕激素类药物，临床用于治疗内异症，结合药理作用，选择其作为阳性对照药物。

表1 异位内膜NGF、trkA和p75 NTR相对蛋白表达水平（±s）

表1 异位内膜NGF、trkA和p75 NTR相对蛋白表达水平（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，与模型组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

分组 NGF trkA P75NTR假手术组（空白组）（n=9）1614047±191350## 29855±3486# 1834047±121340#模型组（n=9）7668541±106908* 75950±2585* 7738521±112608*西药组（n=9）4033076±525020*## 40145±3667#* 4235016±427023*#中药低剂量组（n=9）3624970±187000*## 42856±3073#* 3728975±177663*#中药中剂量组（n=9）2889370±127892*## 40908±1092#* 2983370±167872*#中药高剂量组（n=9）3742795±108346*## 38925±853#* 3682776±156342*#

本研究结果表明,内异症大鼠异位内膜中NGF、trkA、P75NTR的相对蛋白表达水平明显高于正常组（假手术组）。说明神经生长因子NGF、trkA、P75NTR可能参与了内异症的发生发展过程。同时，本研究证实葫芦巴丸加减方可以有效降低异位内膜NGF、trkA、P75NTR的表达水平。葫芦巴丸加减方共8味药，葫芦巴温肾助阳、祛寒止痛，起到标本兼治的作用；巴戟天助葫芦巴补肾温阳；小茴香、吴茱萸具散寒止痛之功效；郁金可活血止痛、行气解郁；莪术、片姜黄则破血以行气，王不留行起活血通经之功效。全方共奏温阳散寒、祛瘀通脉、行气止痛之功效。这些药物成分可以有效抑制神经生长因子NGF、trkA、P75NTR的蛋白表达水平，从而抑制内异症的发生发展过程。

NGF、P75NTR的蛋白表达水平，在中药治疗低、中、高剂量组间比较，中剂量组的结果优于低、高剂量组。可见，给药浓度和NGF、P75NTR的蛋白表达的关系并不是随药物浓度改变的线性关系，这说明药物浓度并非越高越好，合适的用药剂量才能带来最优疗效。我们推测，药物是通过和一些受体结合来产生效应的，随着剂量的增加，和受体结合而产生的效应增加，但随着受体和药物结合出现饱和，导致治疗效应不再继续上升，此时药物剂量继续增加不但不能提高疗效，反而由于过高浓度带来的毒副作用影响，降低了疗效。因此，葫芦巴丸的用药剂量对于子宫内膜异位症的治疗是十分关键的。