CACNA1A、APOE基因多态性与新疆维吾尔族人群剥脱综合征发病的相关性研究

温鑫，陈雪艺

剥脱综合征 (exfoliation syndrome，XFS)是一种与年龄相关的系统性疾病,以细胞外基质中剥脱物质的沉积为特征，表现为灰白色头皮屑样的物质在眼部组织中堆积。沉积物可出现在眼的所有前段结构，包括晶状体囊、虹膜、纤毛体、细带和小梁网，但最常见的部位为瞳孔缘和晶状体前囊[1]。1917年，林德伯格在慢性开角型青光眼的患者的瞳孔周围首次发现并描述了这一物质，然后提出了XFS[2]的概念，人们才逐渐开始对其展开相应的研究。

剥脱综合征在世界范围内均可发病，但其发病情况却不尽相同。XFS在世界范围内好发于斯堪的纳维亚半岛地区[3]。在中国地区，新疆维吾尔族人群较为高发。库车地区研究表明，60岁左右或大于60岁以上的维吾尔族人群中，XFS有2.2%的发生率；而在大于80岁的人群中，这一数字达到9.5%[4]。这充分提示了XFS发病与种族、年龄密切相关。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2012年3月至2013年5月在新疆喀什地区、库车地区以及新疆医科大学第一附属医院确诊为剥脱综合征的维吾尔族人群作为研究组（XFS组），共216例，与研究组生活背景等相匹配并且经严格检查确定无血缘关系的维吾尔族健康人群作为对照组，共297例纳入本研究。所有研究对象均签署知情同意书，并且历经详细的眼科检查（视力、裂隙灯、眼压、前房角镜检查、视野、间接眼底镜等），通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的伦理审查资格。

1.2 诊断标准

XFS诊断标准[5]：（1）眼前段有典型 XFS物质存在于晶体囊，瞳孔缘出现灰白色头皮屑样剥脱物质。晶状体前囊中央有密集粉尘状灰白色膜样小盘或周边部有锯齿状或花边样灰白色颗粒样混浊环带；（2）小梁网色素沉着增多和瞳孔缘虹膜色素花边脱失；（3）视盘和标准自动化视野检查正常；（4）Goldman压平眼压计测量IOP≤21 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

纳入标准：对照组 （1）没有异常物质聚集于眼前段或瞳孔缘；（2）眼压≤21 mm Hg；（3）视野和视盘正常;（4）无青光眼家族史的人群；（5）生活背景与研究组相匹配且无血缘关系的维吾尔族对照组；（6）除了轻微屈光不正外没有其他眼部疾病。XFS组（1）符合 XFS 的诊断标准；（2）维吾尔族人群；（3）同意参加临床研究并签署知情同意书。

排除标准：（1）其他原因引起的继发性青光眼（葡萄膜炎、色素上皮综合征、虹膜角膜内皮综合征）；（2）强烈红外线接触史；（3）自身免疫性疾病；（4）高血压病等心脑血管疾病；（5）恶性肿瘤；（6）糖尿病；（7）肝炎；（8）不能配合完成本研究者。

1.3 方法

每组均取EDTA Na2抗凝的外周血5 ml，立即放入-80℃冰箱备用，用全血基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，通过蛋白/核酸比色仪对提取的全基因组DNA进行定量和纯度分析。针对rs4926244，rs429358，rs7412位点，合成其相应特异性引物进行PCR扩增，取5 μlPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳阳性PCR产物送测序。电泳阳性PCR产物送（北京六合华大基因科技股份有限公司）ABI-PRISM3730测序仪测序分析，测序峰图用Chromas软件和DNAMAN软件分析等位基因、单倍体多态性。明确新疆维吾尔族XFS患者与对照组间外周血CACNA1A基因rs4926244位点、APOE基因rs429358、rs741位点是否存在多态性，是否与新疆维吾尔族人群XFS发病相关。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件，计量资料符合正态分布，进行方差齐性检验后采用两独立样本的t检验，用均数±标准差(x¯±s)来表示，采用 χ2检验比较 XFS组和对照组间基因位点的差异性，是否符合Hardy-Weinberg平衡 （Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），采用χ2检验，比较的参数是XFS组与对照组之间各SNPs位点的基因型。利用双重Logistic回归模型计算基因型及等位基因比值比（oddsratio，OR）及95%置信区间（confidence interval，CI）所有的统计分析采用双侧概率进行检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，证明基因位点与疾病的发生具有相关性。

2 结果

2.1 一般资料

研究组共纳入216例患者，对照组共纳入297人。研究组患者年龄为（69.90±8.47）岁，对照组研究对象年龄为（62.46±9.94）岁，差异有统计学意义(t=9.13，P＜0.01)，在后面行基因位点分析时已用Logistic回归矫正年龄带来的误差。研究组中男146例，女70例，对照组中男159人，女138人，研究组和对照组中性别差异有统计学意义 (t=10.25，P＜0.01)。

2.2 各研究SNPs位点的Hardy-Winberg(HWE)平衡

用卡方检验来验证HWE平衡，XFS组CAC-NA1A基因 rs4926244及 APOE基因 rs429358、rs7412的研究组及对照组均符合HWE平衡（表1）。

表1 XFS组与对照组3个SNP位点的HWE检验比较

2.3 CACNA1A、APOE基因与XFS的关系

CACNA1A基因的rs4926244位点在研究组及对照组中各分型比较无统计学意义（P＞0.05），提示CACNA1A基因的rs4926244位点可能与新疆维吾尔族XFS发病无关。APOE基因的rs429358、rs7412位点在研究组及对照组中各分型比较无统计学意义（P＞0.05），提示 APOE 基因的 rs429358、rs7412 位点可能与新疆维吾尔族XFS发病无关(表2)。

为了进一步探究基因与疾病的关联性，按照rs4926244位点、rs429358位点、rs7412位点分型结果分别建立了不同的遗传模型，包含了Dominant(频率低的allele为显性)，Recessive(频率低的allele为隐性)，Log-additive(叠加作用)。因变量代表参选人群是否患病（否=0，是=1），自变量代表显性模型、隐性模型和加性模型等不同遗传模型，对获得的实验数据进行关联分析，结果表明：无论在年龄矫正前还是年龄矫正后，rs4926244位点、rs429358位点、rs7412位点的P值均＞0.05，差异无统计学意义。故基因多态性与XFS并无关联（表3）。

表2 3个SNP位点在研究组和对照组中的各模型分析结果（单位：例）

表3 基因单倍体多态性与XFS的关联性分析

3 讨论

盲和视力损害是世界范围内的共同难题，XFS是白内障、青光眼的病因之一。XFS发病隐匿，患者常并发白内障、青光眼严重影响视力才来就诊，失去最佳治疗时机而致盲，国内外已有大量文献报道 XFS分布有明显种族及地域特征[6-12]，患病率：0～20%，芬兰[12]：22%，冰岛[12]：29%，而格陵兰岛爱斯基摩人[8]：0，在我国汉族人群中XFS属于少见眼病，香港报道[9]60岁以上患病率为0.4%；新加坡[9]也证实XFS在当地华人中较为少见，患病率为0.7%。

为了更好的了解XFS的病因，Tin Aung等[13]开展了GWAS研究，在日本选取了研究组1484例和对照组1188例，并在后续工作中从来自6个洲的17个国家选取了对照组6901例，研究组20727例进行Meta分析，发现了新的基因CACNA1A的rs4926244与剥脱综合征发病的关联性。这是自LOXL1基因以来的又一新的基因位点。

CACNA1A编码P/Q型电压依赖的钙通道的α1A亚单位。钙通道运送钙离子穿过细胞膜，并在产生和传送电信号中扮演重要作用。之前关于剥脱综合征的电镜研究表明：高浓度钙离子与形成剥脱纤维物质直接相关。另外，原纤维蛋白利用钙离子形成稳定的聚集[14]。我们可以假设钙通道的改变作用可以导致钙离子聚集的改变，这种作用也许更容易形成剥脱物质聚集[15]。关于CACNA1A基因在眼部组织的表达的信息很缺乏，我们从许多人类的眼部组织及癌细胞株中分别发现了mRNA的表达轮廓及蛋白表达。我们发现除了视神经节，CACNA1A基因的mRNA在所有眼部组织中都有所表达，例如睫状体、虹膜、晶状体前上皮、视神经胶质细胞、血管内皮细胞和视网膜感光细胞[16]。

APOE位于19q13.2染色体上，编码APOE蛋白。该蛋白是一种富含精氨酸的碱性蛋白，由299个氨基酸残基组成，相对分子质量为3,4000，含32个精氨酸和12个赖氨酸[15]。APOE的合成是由位于一个基因位点上的3个等位基因，即e2、e3、e4所控制，每个等位基因对应1个主要异构体，产生3种纯合子(E2／2、E3／3、E4／4)和 3 种杂合子(E2／3、E2／4、E3／4)共6种常见的表型。在自然人群中，e3基因频率最高，APOE E3／3 表型分布约占 70%[17-19]。 AI—Dabbagh等[20]的研究表明在沙特阿拉伯人群中，APOE可能是XFS的一个危险因子，而等位基因£3可能起到保护作用。Yilmaz等[21]则报道APOE的等位基因e2与土耳其人群的XFS有密切联系，XFS患者人群中£2基因频率约为50%。也有关于APOE和青光眼关联性的研究，早期的研究资料主要是关于澳大利亚白人[22]、瑞典[23]、英国[24-25]等人群，日本[26]、中国[27]较少有关于这方面的报道，且研究结果并不一致。在德国和挪威的XFS患者中，APOE基因型和基因频率与正常人群没有明显的区别[28-29]。

上述研究表明，CACNA1A基因的rs4926244位点及与APOE基因的rs429358、rs7412位点新疆维吾尔族XFS的发病无关，也许是样本量还不够大。基于流行病学调查却发现XFS高发于新疆维吾尔族，而新疆维吾尔族为相对隔离群体，遗传背景较为单一，居住相对集中和固定，是研究XFS的理想人群[30-32]。本研究中研究组和对照组样本均来自于同一地区、同一个遗传上相对均质的相对隔离群体，因此本研究结论是相对可信的。此外，XFS是多基因变异共同作用所致，每一个基因的单个位点变异对疾病有所影响，对于XFS的发病机制还有待于进一步研究。