Toll样受体在不同转移能力人乳腺癌细胞株中的差异表达及意义研究

赵毅玲 姚丽红 李彩娟 单叔煤 奚克敏 孙迎燕

[摘要] 目的 探讨Toll样受体在不同转移能力人乳腺癌细胞株中的差异表达及意义。 方法 分别选取高转移能力人乳腺癌细胞株MDA-MB231与低转移能力人乳腺癌细胞株MCF-7，采用RT-PCR、实时荧光定量PCR及细胞免疫荧光检测测定其蛋白水平及TLR1-TLR10mRNA水平，比较两株细胞TLRs表达情况及差异性。 结果 人乳腺癌细胞株MCF-7mRNA、MDA-MB-231 mRNA、蛋白水平均存在TLRs广泛表达;两种细胞株TLR4、TLR6、TLR8及TLR9 mRNA水平表达存在明显的差异性（P<0.05）;MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR7及TLR5水平明显高于MCF-7（P<0.05）。 结论 TLRs在不同转移能力人乳腺癌细胞株中表达广泛但水平存在差异，其中TLR4受体差异表现最为明显，考虑TLRs表达差异与乳腺癌细胞转移能力相关。

[关键词] Toll样受体;不同转移能力;人乳腺癌细胞株

[中图分类号] R979.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）17-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the differential expression and significance of Toll-like receptors in human breast cancer cell lines with different metastatic ability. Methods High-metastatic human breast cancer cell line MDA-MB231 and low metastatic human breast cancer cell line MCF-7 were selected， and their protein levels and TLR1-TLR10 mRNA level were determined by RT-PCR， real-time fluorescent quantitative PCR and cellular immunofluorescence assay.The expression and difference of TLRs in the two cells was compared. Results The expression of TLRs was widely expressed in human breast cancer cell line MCF-7 mRNA and MDA-MB-231 mRNA and protein expressions. There are significant differences in the expression of TLR4， TLR6， TLR8 and TLR9 mRNA levels in the two cell lines（P<0.05）. The levels of TLR4， TLR6， TLR7 and TLR5 in MDA-MB-231 are significantly higher than those in MCF-7 （P<0.05）. Conclusion TLRs are widely expressed in different metastatic human breast cancer cell lines， while the expression levels are different. The difference of TLR4 receptors is the most obvious， considering that the difference of TLRs expression is related to breast cancer cell metastasis ability.

[Key words] Toll-like receptor; Different metastatic ability; Human breast cancer cell line

近年來分子水平的研究为乳腺癌的诊治带来了新的方向和希望，相关分子标志物表达的检测有助于了解恶性程度和判断预后，继而通过合理治疗以达到控制肿瘤的目的[1]，进而实现对后天免疫系统的调整。最新研究证实，TLRs在多种肿瘤细胞中均有广泛表达[2]，但目前还鲜有关于其在乳腺癌中的表达研究。本研究拟采用超声弹性成像技术、免疫组织化学染色方法、实时定量PCR技术对乳腺癌患者患病部位进行超声弹性成像评价，对肿瘤组织中Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）的表达情况进行检测，并将TLRs表达与超声弹性成像（UE）特征进行比较，探讨二者之间的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂  Trizol试剂由北京奥维亚生物技术有限公司提供;逆转录试剂由北京亿鸣联创生物科技有限公司提供;PCR反应试剂由上海诺晶生物科技有限公司提供，TLR1～TLR10以及GAPDH引物由上海生工合成;DMEM培养基由北京索莱宝科技有限公司提供;新生牛血清购自上海远慕生物科技有限公司;TLR兔抗人多克隆抗体由上海万疆生物技术有限公司提供。

1.1.2 仪器  Alpha-1900Plus紫外分光光度仪购自上海谱元仪器有限公司;CAS IR GRID聚合酶链反应仪由苏州东胜兴业科学仪器有限公司提供，HI VISION Ascendus超声诊断仪日本日立公司;Philips iu Elite超声诊断仪荷兰飞利浦公司。Toshiba Aplio XG 超声诊断仪日本东芝公司;ABI-7000荧光定量PCR仪，美国ABI公司;LightCycler 480 II荧光定量PCR仪瑞士罗氏公司;Easypure uv/uf超纯水制造仪美国BARNSTEAD公司;i Cycler PCR 扩增仪由美国BIO-RAD公司提供;凝胶图像分析系统（UVPGDS-8000）由美国 BIO-RAD 公司提供;稳压稳流电泳仪（DYY-6B）由六一仪器厂（北京）提供;可调微量加样器（Eppendprf）由德国Eppendprf公司提供。

1.2 标本收集

研究数据采集期间收集牡丹江医学院红旗医院乳腺癌患者100例，均获得最终手术病理结果，术前行常规超声检查，记录病灶的大小（纵横比）、形状是否规则、边界是否清晰、内部有无小钙化、后方伴或不伴回声衰减等特点。研究时间为2016年12月～2017年12月，确保样本的保存空间和温度，避免受其他不良因素对样本的影响。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养  MDA-MB-231、MCF-7细胞株均购自上海中国科学院细胞库。采用10%胎牛血清RPMI 1640细胞培养液对MDA-MB-231进行培养，采用10%胎牛血清及0.01 g/L牛胰岛素的DMEM細胞培养液对MCF-7进行培养，在容量为50 mL培养瓶中接种，温度设置为37℃，CO2浓度为5%，培养48 h后更换培养液，待其进入对数生长周期予以收获。

1.3.2 总RNA提取及逆转录  在1 mL Trizol中添加2.0×106个细胞，经过分层、沉淀及洗涤后，半干后采用0.1% DEPC进行水解，紫外分光光度仪设置为1.8～2.0，在-70℃环境下保存。行25 μL反应体系逆转录，严格按照相关试剂盒说明操作，将第一链cDNA保存在-20℃环境下。

1.3.3 普通PCR  设置退火温度55℃对TLT1-TLR10以及GAPDH水平予以检测。2×PCR均为10 μmol/L上下游引物，各0.5 μL。cDNA为1 μL，循环参数：94℃5 min预变性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，共循环35次，在72℃温度下进行5 min延伸。扩增处理后给予空白对照，实验均反复3次。在1.2%琼脂糖凝胶中加入8 μL扩增产物进行电泳，对成像结果予以观察。

1.3.4 流式细胞仪检测  本部分研究对于TLRs表达采取免疫组织化学进行检测。首先，将选取的新鲜活检组织给予10.0%甲醛进行固定，并采取梯度酒精进行脱水处理，采取二甲苯透明和石蜡的包埋处理。将石蜡切片进行HE染色，并且在每张切片滴加相应对应的一抗，最后进行DAB显色和苏木精复染处理，并在显微镜下进行观察与判断。见封三图3。

1.3.5 Real-time PCR检测TLRs mRNA表达量的变化  本部分研究采用实时定量荧光PCR（Real-time PCR）法检测乳腺癌组织中TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的水平情况。①RNA提取：取肿瘤组织，TRIzol匀浆后加入氯仿震荡、离心，取上清，加入异丙醇，震荡后离心，空气干燥，测RNA浓度。②cDNA合成，取RNA，加入引物、反应底物后，适宜条件下反应，检测cDNA。③以cDNA为模板，加入SYBGREEN和引物行PCR扩增，检测 TLRs mRNA水平变化。同时以管家基因葡萄糖磷酸脱氧酶作为内参照，每份样品均进行3次重复检测，取其平均CT值用于分析。

以上所有实验均开展3次，选取平均值。用于比较不同的检测指标差异。

1.4 统计学方法

所得数据采用SPSS 21.0统计学软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用Cellquest软件对流式数据进行分析。

2 结果

2.1 流式细胞仪技术检测表达比较

MDA-MB-231当中TLRs蛋白表达结果当中比较高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7当中TLR4和TLR6是蛋白表达水平最高的。见表1、图1。

2.2 实时荧光定量PCR测定TLRs基因定量表达情况

乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，TLR4表达为（25.67±1.12），是MCF-7的（12.22±1.40）倍（P<0.05），另外TLR6、TLR8及TLR9均显著高于MCF-7对应表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 细胞免疫荧光测定TLR4蛋白表达情况

计算20个视野平均值，得到MDA-MB-231细胞TLR4阳性细胞表达率为（86±4）%，显著高于MCF-7的（51±7）%，差异有统计学意义（t=19.415，P<0.01）。

3 讨论

文献报道，TLRs在天然免疫系统及小鼠、人类的肿瘤细胞中均呈广泛表达[3]。现有研究证实人宫颈癌细胞、前列腺癌细胞及胃癌细胞等均存在TLR4表达[4]。乳腺癌越早期发现、治疗则预后较好，因此，早期诊断和治疗具有重要意义。超声检查作为一种快捷、安全、无创的检查方法，目前成为乳腺疾病诊断的主要手段之一，由于病灶的硬度与周围正常组织往往不同，恶性肿瘤的病变组织自身较坚硬，并与附近组织粘连，硬度会更大[5-6]。弹性成像技术可通过检测乳腺病灶与周围组织的相对硬度从而辅助诊断乳腺病灶的良恶性[7]。炎症因子的过度表达及慢性炎症微环境适应和促进了肿瘤细胞的增殖、生长、血管形成和转移，增加发展成恶性肿瘤的风险[8]。TLRs是新近发现的参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。其可营造炎症微环境导致肿瘤形成，并在肿瘤形成基础上促进肿瘤进展[9-10]。

我们通过检测乳腺癌患者肿瘤组织弹性与其TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的表达情况，探讨其在研究对象肿瘤组织中表达的差异与肿瘤弹性变化的关系，旨在为乳腺癌的诊治提供实验诊断参考和疗效评价标准。TLR4激活的信号通路与肿瘤的发展有密切的关系[11]。近年研究发现，TLR4在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达上调。TLR4信号途径对前列腺癌的生长及转移有着一定的促进作用[12]。在TLR4及NF-κB依赖途径下，细菌内毒素LPS能够激活尿激酶纤维蛋白溶酶，增强结直肠癌细胞黏附及侵袭能力[13]。

已有不少学者开展了Toll样受体相关的内容研究，如肖蔷[14]分析了在乳腺癌细胞系当中Pirh2、p53表达的意义，发现Pirh2、p53的表达与乳腺癌细胞侵袭转移能力相关，王涛等[15]分析了Toll样受体4活化增强乳腺癌细胞株MCF-7侵袭力的效果，发现脂多糖可增强MCF-7细胞株TLR4的表达，增强乳腺癌细胞的侵袭力。李娜等[16]分析缺氧诱导因子-2α在不同侵袭能力乳腺癌细胞和组织中的表达及意义，发现缺氧诱导因子-2α可能与乳腺癌转移有关。唐乐辉等[17]则是研究了在乳腺癌当中Toll样受体在乳腺癌转移机制当中的作用，发现TRIF可能促进乳腺癌的增殖、分化。除此之外，还有其他学者对Toll样受体在乳腺癌组织中的表达结合青岛地区开展研究，发现TLRs乳腺癌中高表达，TLR2可能增加青岛地区女性患乳腺癌的风险[18]。卫文俊等[19]分析了TLR4在乳腺癌组织中的表达与微血管密度的关系及临床意义，发现TLR4在乳腺癌组织中表达增高，可促进新微血管的形成。张馨月等[20]也开展了Toll样受体与乳腺癌、通路相关衔接蛋白之间的关系，为中医药抗乳腺癌的运用及明确其作用机制提供了实验依据。这些均为研究理论的丰富奠定了坚实的基础。

本研究发现，MDA-MB-231及MCF-7均存在TLR1～TLR10在mRNA中表达。乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，TLR4、TLR5及TLR6高表达，而MCF-7中TLR5高表达。经实时荧光定量PCR测定发现，乳腺癌细胞株MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR8及TLR9均高于MCF-7。在蛋白质水平上，MDA-MB-231当中TLRs蛋白表达结果当中比较高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7当中TLR4和TLR6是蛋白表达水平较高，与mRNA水平基本一致。表明TLR4与TLR6是2株细胞间差异较大的受体，而TLR4差异最明显。TLR4与肿瘤的转移有密切关系，促进了乳腺癌的生长、黏附及侵袭。另外，本研究中TLR1、TLR3～8、TLR10在2株细胞间差异表达，可能與乳腺癌细胞转移能力相关，参与其转移过程。

此次研究发现TLRs的差异化表达与乳腺癌细胞转移能力具有一定的相关性，且TLRs在乳腺癌转移中具有重要的参与作用，该结论能够为乳腺癌转移机制研究提供借鉴。

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（收稿日期：2018-11-23）