化疗药物对大鼠卵巢储备功能的影响

梁元晶 曾婷婷 路欣

【摘要】 目的：探讨化疗药物顺铂对大鼠卵巢储备功能和抗中肾旁管激素（AMH）表达的影响。方法：清洁级成年雌性SD大鼠随机分为对照组（生理盐水）、顺铂低剂量组和顺铂高剂量组，分别进行药物腹腔注射。观察动物的一般情况，称量动物体重，ELISA方法检测血清中AMH水平。结果：（1）与对照组相比，顺铂低剂量和高剂量组动物的一般状态差，体重明显降低（P<0.001）。（2）对照组注射后体重比注射前明显升高（P<0.001），而另外两组注射后体重均比注射前显著降低（P<0.05）。（3）与对照组相比，顺铂低剂量和高剂量组血清AMH水平均显著下降（P<0.001）;而与顺铂低剂量组相比，高劑量组AMH水平进一步下降（P<0.05）。结论：化疗药物顺铂能使大鼠体重和血清AMH水平显著降低，卵巢储备功能下降。AMH是衡量顺铂作用后大鼠卵巢储备功能的重要生物学指标。

【关键词】 卵巢储备; 化疗; ELISA

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of chemotherapeutic agent cisplatin on anti-Müllerian hormone（AMH）expression and ovarian reserve in rats.Method：Adult SD female rats were divided into control group（saline），cisplatin low-dose group，and cisplatin high-dose group randomly.Agents were injected by intraperitoneal injection.General condition of the animal was observed.Body weight was measured.Serum AMH level was measured by ELISA.Result：（1）Compared with control group in cisplatin low-dose and high-dose groups，the general conditions of animals became worse，and the body weight decreased significantly（P<0.001）.（2）In control group，the body weight after injection increased significantly compared with before injection（P<0.001）.While in cisplatin groups，the weight after injection decreased significantly compared with before injection（P<0.05）.（3）Serum AMH levels in cisplatin groups decreased dramatically compared with control group（P<0.001）.Moreover，AMH levels in cisplatin high-dose group was much lower than that of low-dose group（P<0.05）.Conclusion：Chemotherapeutic agent cisplatin results in the decrease of body weight and serum AMH level.The lower AMH levels indicate the diminishment of ovarian reserve after cisplatin treatment.AMH is a very good marker of ovarian reserve after cisplatin administration.

【Key words】 Ovarian reserve; Chemotherapy; ELISA

First-authors address：Capital Medical University School of Basic Medical Sciences，Beijing 100069，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.007

据WHO统计，2008年城市女性恶性肿瘤发病率为248.7/10万，较20年前增加45.35%。放疗和化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段，但许多化疗药物具有卵巢毒性，可导致卵巢储备功能损伤，甚至引起卵巢早衰[1-3]。“卵巢储备功能”是衡量女性卵巢功能和生育能力的重要指标，它包括卵子的质量和数量[4]。抗中肾旁管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）又称苗勒管抑制物，在雌性体内主要由卵巢中的生长卵泡，即初级卵泡、窦前卵泡和小的窦状卵泡分泌。近年来，AMH评价卵巢储备功能的作用受到广泛关注[5-7]。但是，在化疗药物顺铂作用后，雌性大鼠体内AMH水平是否发生改变，这种AMH水平的变化与卵巢储备功能之间是否存在某种联系，目前国内尚未见相关研究报道。本研究检测不同剂量顺铂给药后大鼠的一般状态、体重和血清AMH水平，探讨顺铂对卵巢储备功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 本研究选用健康的清洁级成年雌性SD大鼠，65～75天，体重200～250 g，共40只。动物由Harlan（Indianapolis，IN）提供。本研究中所用试剂：顺铂购于Sigma-Aldrich公司，AMH ELISA试剂盒购于Diagnostic Systems Laboratories公司。

1.2 动物模型制备及分组 SD大鼠饲养于屏障环境内，自由饮水、采食。喂养中的昼夜节律为12 h光照，12 h黑暗。经过一周的适应期后，大鼠随机分为3组：对照组（12只）、顺铂低剂量组（16只）和顺铂高剂量组（12只）。用生理盐水配制终浓度为0.5 mg/mL的顺铂溶液。上述三组动物分别进行腹腔注射生理盐水1 mL、顺铂4.5 mg/kg或顺铂6.0 mg/kg，每周注射一次，共两周。实验过程中，定期检查动物的一般情况并称量体重。

1.3 标本采集 药物注射结束后，二氧化碳吸入法麻醉并处死动物。进行心脏采血，离心，分离血清并分装，储存于-80 ℃。

1.4 ELISA检测 用AMH ELISA试剂盒检测大鼠血清中AMH的水平，具体操作按说明书进行，简述如下。取20 μL标准品、对照品和血清样本，加入96孔板中，孵育、洗板。再将生物素标记的抗体加入，孵育、洗板。此后，加入HRP，孵育、洗板。最后，TMB显色，酶标仪测450 nm和620 nm处波长。该方法的检测敏感度为0.017 ng/mL，同一次检测的变异系数为4.6%，不同次检测间的变异系数为8.0%。

1.5 统计学处理 使用SPSS 11.0统计学软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，运用配对t检验，分析各组内药物注射前后体重的变化;运用单因素方差分析及Post-hoc分析，对药物注射后各组间体重的差异和AMH的差异进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态的变化 药物注射过程中，三组动物的一般情况发生一些变化。其中，对照组大鼠生长、进食及精神状态良好，反应灵敏，体重有所增加。顺铂低剂量组大鼠精神稍差，不活跃，略显消瘦。而顺铂高剂量组大鼠进食量及活动明显减少，精神倦怠，明显消瘦。

2.2 动物体重的变化 药物注射2周后，顺铂使动物体重显著下降，顺铂低剂量组动物体重与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.001）;顺铂高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000）;顺铂高剂量组与低剂量组比较，差异有统计学意义（P=0.000）。注射后，对照组体重较注射前显著增加（t=-7.717，P=0.000），顺铂低剂量组体重较注射前明显下降（t=2.174，P=0.046），顺铂高剂量组体重较注射前明显下降（t=4.156，P=0.004），见表1。

2.3 血清AMH的ELISA检测 药物注射后，各组大鼠血清中AMH的水平为对照组（5.30±0.51）ng/mL，顺铂低剂量组（1.78±0.17）ng/mL，顺铂高剂量组（0.52±0.10）ng/mL。注射顺铂后，大鼠血清AMH水平显著下降，顺铂低剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000）;顺铂高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000）;顺铂高剂量组与低剂量组相比，差异有统计学意义（P=0.008）。

3 讨论

据WHO统计，2008年城市女性恶性肿瘤发病率为248.7/10万，较20年前增加45.35%。放疗和化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段，但许多化疗药物具有卵巢毒性，可导致卵巢功能损伤，甚至引起卵巢早衰[1-3，8-9]。Oktem等[10]对26例患者的卵巢形态学和功能研究显示：化疗组卵巢中原始卵泡数目明显低于对照组，接受烷化剂治疗患者的原始卵泡数目明显低于非烷化剂组及非化疗组;化疗组患者的卵巢皮质组织块体外产生的雌激素量明显低于对照组。提示化疗药物可以破坏卵巢的正常结构，降低卵巢储备功能。顺铂是中心以二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物，类似于双功能烷化剂，属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上的结构，有较强的广谱抗癌作用。在临床用于治疗卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤，均能显示疗效。顺铂在治疗恶性肿瘤的同时，也具有毒副作用，可造成多脏器损伤，例如：肾脏毒性、神经毒性和电解质紊乱，少数患者还可出现心电图ST-T改变，肝功能损害等[11]。顺铂对卵巢也有一定的损伤。研究显示：顺铂腹腔注射后，小鼠卵巢中卵泡计数减少，卵泡闭锁增加，细胞间质增生明显，卵巢呈现“纤维化”改变，进而影响到卵巢功能。

卵巢储备功能包括卵巢内存留的卵泡数量和卵泡质量两个方面，代表女性配子发生及甾体激素生成的能力，可反映女性的生育潜能[4，12-13]。目前，临床常用克罗米芬刺激试验、第3天FSH水平和B超下卵泡记数等指标来反映卵巢储备功能。但是，在同一个体中，常出现几种指标不一致的情况，从而不能为临床医疗提供非常可靠的依据。近年来，AMH评价卵巢储备功能的作用受到广泛关注[5-6，7，14]。AMH又称苗勒管抑制物，是由二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族的一個成员。与TGF-β家族其他成员的广泛表达不同，AMH的表达仅限于性腺。在雄性，AMH主要由睾丸支持细胞表达;在雌性体内主要由卵巢中的生长卵泡分泌。最近的研究显示，AMH的水平可以更加准确、早期地预测卵巢储备功能[15-16]。然而，应用AMH作为检测指标，探讨化疗药物顺铂作用后卵巢储备功能的变化，这方面的研究报道在国内很少见到。

本研究笔者首先给予实验动物腹腔注射顺铂。因为顺铂作用于大鼠的LD50为6～12 mg/kg[17]，所以笔者分别选用了顺铂低剂量（4.5 mg/kg）和高剂量（6.0 mg/kg）两种注射浓度，其中后者相当于顺铂的LD50，而前者约相当于LD50的75%。研究显示：注射顺铂后，与对照组相比，顺铂低剂量和高剂量组动物的一般状态差，体重明显降低（P<0.001）。而与顺铂低剂量组相比，高剂量组动物的体重再次出现大幅度下降（P<0.001）。此外，若对每一组动物注射前后的体重进行比较，则可发现：对照组注射生理盐水后体重比注射前明显升高（P<0.001），提示在实验进行中，对照组动物生命活动正常，生长发育未受影响。而另外两组动物在注射顺铂以后体重均比注射前显著降低（P<0.05）。上述实验结果提示，本研究中无论高剂量或低剂量顺铂腹腔注射，药物的毒副作用均已对大鼠身体造成不同程度的伤害，阻碍了其正常的生长发育，导致体重的大幅度下降。随着剂量的增加，顺铂的损伤作用也越来越严重。

在此基礎上，笔者进一步探讨了顺铂对血清AMH水平的影响。文献报道，血清AMH水平能够间接反映生长卵泡数量和原始卵泡库存量的变化，可以作为检测卵巢储备功能的重要标志物[15]。本研究显示：注射顺铂后，与对照组相比，顺铂低剂量和高剂量组AMH水平均有显著下降（P<0.001）。而顺铂高剂量组与低剂量组相比，AMH水平继续降低（P<0.05）。血清AMH的降低提示注射顺铂后大鼠卵巢储备功能的下降。结合上述体重变化趋势，可以发现，化疗药顺铂可对大鼠器官系统造成不同程度的伤害，包括降低卵巢储备功能。随着顺铂使用剂量的升高，伤害将逐渐加重，卵巢储备功能也持续大幅度下降。

随着医学技术的进步和化疗等治疗措施的广泛应用，部分恶性肿瘤的预后正逐步改善，患者生存期明显延长。生存不再是肿瘤治疗的唯一目的，患者对高质量生活的渴望正受到更多关注，而卵巢功能状态也成为衡量女性肿瘤患者生存质量的重要指标之一[18-20]。本实验中，应用化疗药物顺铂能使大鼠体重和血清AMH水平显著降低，而AMH的降低又标志着卵巢储备功能的下降。本研究所获结果为化疗后卵巢储备的准确检测提供了实验依据，并使深入探讨如何在化疗的同时保护卵巢储备功能、提高患者生存质量成为可能。

参考文献

[1] Grossmann K F.Adjuvant treatment for patients with surgically resected advanced-stage melanoma[J].Clin Adv Hematol Oncol，2015，13（10）：633-635.

[2] Anderson R A，Mansi J，Coleman R E，et al.The utility of anti-Müllerian hormone in the diagnosis and prediction of loss of ovarian function following chemotherapy for early breast cancer[J].Eur J Cancer，2017，87：58-64.

[3] Lee D Y，Kim S K，Kim M，et al.Fertility preservation for patients with hematologic malignancies：The Korean Society for Fertility Preservation clinical guidelines[J].Clin Exp Reprod Med，2017，44（4）：187-192.

[4] Randolph J F，Harlow S D，Helmuth M E，et al.Updated assays for inhibin B and AMH provide evidence for regular episodic secretion of inhibin B but not AMH in the follicular phase of the normal menstrual cycle[J].Hum Reprod，2014，29（3）：592-600.

[5] Cerra C，Oliver J，Roberts S A，et al.A single nucleotide polymorphism of bone morphogenic protein-15 is not associated with ovarian reserve or response to ovarian stimulation[J].Hum Reprod，2014，29（12）：2832-2837.

[6] Alebic M ?，Stojanovic N，Dewailly D.Discordance between serum anti-Müllerian hormone concentrations and antral follicle counts：not only technical issues[J].Hum Reprod，2018，33（6）：1141-1148.

[7] Gracia C R，Shin S S，Prewitt M，et al.Multi-center clinical evaluation of the Access AMH assay to determine AMH levels in reproductive age women during normal menstrual cycles[J].J Assist Reprod Genet，2018，35（5）：777-783.

[8] Nguyen Q N，Zerafa N，Liew S H，et al.Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility[J].Cell Death Dis，2018，9（6）：618.

[9] Kozub M M，Prokopiuk V Y，Skibina K P，et al.Comparison of various tissue and cell therapy approaches when restoring ovarian，hepatic and kidneys function after chemotherapy-induced ovarian failure[J].Exp Oncol，2017，39（3）：181-185.

[10] Oktem O，Oktay K.Quantitative assessment of the impact of chemotherapy on ovarian follicle reserve and stromal function[J].Cancer，2007，110（10）：2222-2229.

[11]孟晓燕，黄雯静，阳延松，等.顺铂致大鼠急性肾损伤肾组织细胞凋亡及NGAL的相关性研究[J].中国创新医学，2017，14（5）：49-52.

[12] Karlberg S，Tiitinen A，Alfthan H，et al.Premature ovarian insufficiency and early depletion of the ovarian reserve in the monogenic Mulibrey nanism disorder[J].Hum Reprod，2018，33（7）：1254-1261.

[13] Thomas S，Acharya M，Muthukumar K，et al.Effectiveness of Anti-Mullerian hormone-tailored protocol compared to conventional protocol in women undergoing in vitro fertilization：A randomized controlled trial[J].J Hum Reprod Sci，2018，11（1）：24-28.

[14] De Laveleye M，Gruson D.Anti-Müllerian hormone testing：Evaluation of a novel method allowing more automation[J].Scand J Clin Lab Invest，2015，75（8）：681-685.

[15]梁元晶，XU C，KIM B，等.不同年龄大鼠血清抗中肾旁管激素水平与卵巢储备功能的关系[J].中国比较医学杂志，2008，18（6）：31-35.

[16] Pal L，Bevilacqua K，Zeitlian G，et al.Implications of diminished ovarian reserve（DOR）extend well beyond reproductive concerns[J].Menopause，2008，15（6）：1086-1094.

[17] Martin-Marero A，Trinidad A.Supporting cells as a target of cisplatin-induced inner ear damage：therapeutic implications[J].Laryngoscope，2004，114（3）：533-537.

[18] Shisler R，Sinnott J A，ang V，et al.Life after endometrial cancer：A systematic review of patient-reported outcomes[J].Gynecol Oncol，2018，148（2）：403-413.

[19] Pisu M，Kenzik K M，Rim S H，et al.Values and worries of ovarian cancer patients[J].Gynecol Oncol，2017，147（2）：433-438.

[20] Swift B E，Leung E，Vicus D，et al.Laparoscopic ovarian transposition prior to pelvic radiation for gynecologic cancer[J].Gynecol Oncol Rep，2018，24：78-82.

（收稿日期：2018-06-14） （本文編辑：周亚杰）