小檗碱对PCOS大鼠子宫内膜PPARs的表达及内分泌代谢的影响

尹天晓 温菁 魏巍

【摘要】 目的：探讨小檗碱对多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜PPARs的表达及内分泌代谢的影响。方法：采用Poretsky造模法，对大鼠造模。造模后将大鼠随机分为正常对照组、模型组、罗格列酮组、小檗碱组，每组10只。采用灌胃的方法给药，正常组及模型组给予生理盐水，每日对大鼠行阴道涂片，瑞氏染色法观察其动情周期，OGTT测其血糖变化，用ELISA检测E2、FSH、LH、T、INS等指标，计算HOME-IR，取大鼠卵巢及子宫进行HE染色及免疫组化。结果：小檗碱可使子宫内膜PPARα、γ值升高，改善PCOS大鼠糖代谢异常，降低LH、T、INS水平，改善卵巢多囊样表现及子宫腺肌症样表现。结论：小檗碱对子宫内膜PPARα、γ高表达，可恢复大鼠动情周期，改善卵巢激素变化及糖代谢和胰岛素抵抗，且其疗效优于罗格列酮。

【关键词】 多囊卵巢综合征; 小檗碱; 过氧化物酶体增殖物激活受体; 代谢

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Berberine on the expression and endocrine metabolism of PPARs of endometrium in rats with polycystic ovary syndrome.Method：Poretsky modeling method was used to model rats.Rats were randomly divided into the normal control group，model group，Rosiglitazone group and Berberine group，10 rats in each group.The normal group and the model group were given normal saline.Daily vaginal smear was performed on rats，and the estrus cycle was observed by rehman staining.The changes of blood glucose were measured by OGTT，E2，FSH，LH，T，INS and other indicators were detected by ELISA，and HOME-IR was calculated.HE staining and immunohistochemistry were performed in the ovary and uterus of rats.Result：Berberine could increase the PPARα，γ of endometrium，improve glucose metabolism abnormality in PCOS rats，decrease LH，T，INS level，improve the ovarian polycystic appearance and adenomyosis.Conclusion：Berberberine can cause high expression of PPARα，γ on endometrial ，restore emotional cycle，improve ovarian hormone changes，glucose metabolism and insulin resistance，and its effect is better than Rosiglitazone.

【Key words】 PCOS; BBR; PPARs; Metabolic

First-authors address：Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.001

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期妇女常见的内分泌疾病，排卵障碍及异常的内分泌改变使子宫内膜分化不良，影響胚胎植入，导致低妊娠率和高流产率[1]。此外，还影响子宫内膜正常的周期性变化，导致子宫内膜可能有不同程度的增生，发展为子宫内膜癌的风险也增加[2]。常伴胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和肥胖[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一种核内受体转录因子，具有多种生物学效应。可增强机体对胰岛素的敏感性，促进脂肪细胞分化和脂肪生成，调节体内糖平衡，抑制炎症因子生成及炎症反应。与胰岛素抵抗有着密切的关系，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物（TZDs）的作用靶点[4]。近年研究发现PPARs在人类生殖系统中表达，且参与卵巢雌、孕激素的合成并影响受孕，通过影响组织的重塑方式调节卵泡的发生、排卵和黄体的发育，参与胚胎发育及调节胎盘功能、维持妊娠等[5]。

小檗碱（Berberine）是黄连的主要成分之一，在以往主要用于胃肠疾病。最新研究发现，BBR具有明显的降糖、降血脂作用，可明显降低2型糖尿病患者的血糖、血脂水平，改善胰岛素抵抗[6-7]，疗效肯定。同时发现BBR作为中药单体是一种PPARα、β、γ泛激动剂[8]。研究发现PPARγ参与调节子宫的正常生理功能，调节类固醇激素的分泌，与胰岛素抵抗相关[9]。但PPARα、β是否参与生殖功能的调节目前尚无相关研究，且PPARγ在子宫内的调节机制不清。为此本实验应用BBR对PCOS大鼠模型进行治疗，观察其对PCOS大鼠子宫内膜PPARs及内分泌代谢的影响，为了解BBR对PPARs的调节提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 重组人胰岛素注射液（北京赛生药业有限公司）;注射用人绒毛膜促性腺激素（hCG，宁波人健药业集团股份有限公司）;小檗碱（东北制药）;罗格列酮（成都恒瑞制药有限公司）;酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自上海朗顿生物技术有限公司;兔四步法检测试剂盒（中杉金桥）;PPARα、β、γ抗体购自北京博奥森生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及造模 选用85日龄SD雌性大鼠40只随机分为对照组（10只）和模型组（30只）。模型组第1～21天颈背部皮下注射INS 2.0 IU/d，生理盐水稀释至0.2 mL，1次/d。第11～21天，皮下注射hCG 3.0 IU/d，2次/d。以5%葡萄糖溶液替代日常饮水，正常组皮下注射生理盐水0.2 mL/d及1%羟甲基纤维素水溶液0.5 mL灌胃1次，共计21 d，全部大鼠每周称体重1次，每日进行阴道涂片检查;阴道上皮细胞持续角化，提示无排卵表明大鼠模型制作成功。

1.2.2 给药方法 造模成功后将模型组大鼠随机分为模型对照组、罗格列酮组、小檗碱组，每组10只，每天分别给予0.9%生理盐水5 mL、小檗碱300 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液），罗格列酮200 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液）灌胃。每日行阴道涂片观察各组大鼠动情周期变化，28 d后行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）测定大鼠各时间血糖值。

1.2.3 观察内容及方法 动情周期：连续2个周期阴道脱落细胞涂片，瑞氏染色观察大鼠动情周期。OGTT试验：大鼠禁食、不禁水12 h，以3 g/kg剂量灌服50%葡萄糖溶液，尾尖取血，血糖仪测定大鼠灌糖后 0、60及120 min的血糖值。ELISA法检测大鼠血清E2、INS、FSH、LH及T水平，HOMA-IR=空腹血浆胰岛素（μU/mL）×空腹血浆葡萄糖（mmol/L）/22.5。HE染色及免疫组化观察大鼠卵巢及子宫形态学变化：子宫组织免疫组化，计算子宫组织PPARs的變化。

1.3 统计学处理 使用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，符合正态分布计量资料多组间比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验动物阴道涂片 （1）模型组：阴道涂片无周期变化。（2）正常组：阴道涂片呈周期性变化，发情前期（阴道上皮呈膨大椭圆扁平状）-发情期（鳞状上皮脱落，镜下堆叠）-发情后期（大量白细胞，少量角化上皮）-静止期（大部分白细胞，少量较小有核扁平上皮）周期变化。（3）小檗碱组及罗格列酮治疗组：动情周期变化同正常对照组。见图1。

2.2 各组实验动物空腹FPG、FINS、HOME-IR激素水平比较 与对照组相比，模型组FINS升高（P=0.00<0.05）;与模型组相比，小檗碱组与罗格列酮组FINS降低（P=0.00<0.05），罗格列酮组与小檗碱组FINS比较，差异均无统计学意义（P=0.47>0.05）。对照组与模型组FPG比较，差异无统计学意义（P=0.20>0.05），与模型组相比小檗碱组与罗格列酮组FPG差异均无统计学意义，罗格列酮组与小檗碱组组FPG比较，差异无统计学意义（P=0.43>0.05）。与对照组相比，模型组HOME-IR升高（P=0.00<0.05），与模型组相比小檗碱组与罗格列酮组HOME-IR降低（P=0.00<0.05），与罗格列酮组相比小檗碱组HOME-IR降低（P=0.00<0.05）。见表1。

2.3 各组实验动物空腹OGTT比较 与对照组相比，模型组OGTT第1、2小时血糖水平升高（P=0.01<0.05）;与模型组相比，小檗碱组、罗格列酮组OGTT第1、2小时血糖水平降低（P=0.00<0.05）;小檗碱组与罗格列酮组间比较，差异无统计学意义（P=0.43>0.05）。见表2。

2.4 各组实验动物空腹血清激素水平比较 与对照组、小檗碱组及罗格列酮组相比，模型组LH、T明显升高（P=0.00<0.05）;对照组与小檗碱组LH相比较，差异无统计学意义（P=0.43>0.05）。与对照组相比，其余三组FSH明显升高（P=0.00<0.05），小檗碱组和罗格列酮组之间FSH比较差异无统计学意义（P=0.58>0.05）。与对照组相比，模型组E2降低，差异有统计学意义（P=0.04<0.05），小檗碱组和罗格列酮组T水平比较差异无统计学意义（P=0.16>0.05）。见表3。

2.5 HE染色结果 （1）模型组：卵巢组织镜下见多个卵泡，呈不规则囊性扩张状且囊状范围大，占整个标本1/3～1/2面积大小。囊内未见卵母细胞及间质腺，卵泡周围颗粒细胞层数减少，从1到3层分布不等，颗粒细胞数量也随之降低，正常发育的卵泡减少，子宫组织间腺体增加。（2）罗格列酮及小檗碱治疗组：卵巢未见明显卵泡囊性扩张，镜下可见多个各阶段卵泡，呈从小到大分布。卵泡周围颗粒细胞逐层分布，颗粒细胞层数4～7层不等，可见卵丘不规则分布于卵泡中，子宫形态基本正常。见图2、3。

2.6 免疫组化结果 （1）与对照组相比模型组PPARα表达下降（P=0.00<0.05），与罗格列酮组和模型组相比小檗碱组PPARα升高（P=0.00<0.05），与模型组相比罗格列酮组PPARα升高（P=0.00<0.05）;（2）PPARβ在各组间比较差异均无统计学意义（P=0.61>0.05）;（3）与对照组相比模型组PPARγ表达下降（P=0.00<0.05），与模型组相比小檗碱组、罗格列酮组PPARγ升高（P=0.00<0.05），与罗格列酮组相比小檗碱组PPARγ升高（P=0.04<0.05）。见表4、图4～6。

3 讨论

3.1 小檗堿对子宫内膜PPARs的表达 PPARs在动物体内有着广泛的生物学作用，可调节脂类代谢、能量收支平衡以及细胞分裂分化等重要生理过程。目前对PPARγ的研究较多，其激动剂如TZDs可以增加胰岛素敏感性并降低血糖，同时促进脂类存储和脂肪形成。在2型糖尿病动物模型中，有效的选择性的PPARγ激动剂可以改善IR并降低其血糖[10-11]。BBR为PPARs的泛激动剂，可以通过调节PPARs的表达，达到治疗PCOS的目的。罗格列酮为TZDs类药物，有研究认为是PPARγ的单激动剂，其临床应用副作用较大。本实验结果显示，BBR及罗格列酮对子宫内膜PPARα、γ的表达均高于模型组，PPARβ表达与模型组无明显差异，说明BBR和罗格列酮均可使子宫内膜PPARα、γ呈现高表达。

3.2 小檗碱对生殖内分泌与代谢的影响 BBR是从传统中药黄连根茎中提取的异喹啉类生物碱。近年来研究表明，BBR除具有传统胃肠药的作用外，还能够改善IR，降低血糖、血脂，增加胰岛素敏感性而用于2型糖尿病的治疗，且无明显不良反应[6-7]。BBR的作用特点和罗格列酮类似，属胰岛素增敏剂，临床可用于糖耐量异常和轻度高血糖患者[12]，相关实验研究表明BBR可明显改善糖尿病患者的IR情况[13]，并且笔者前期通过临床试验，比较BBR及二甲双胍对PCOS患者的疗效，BBR的效果显著，并且副作用小[14]。有研究发现BBR能改善PCOS患者的向心性肥胖，调节血脂，减轻体重，改善慢性炎症[15-16]。本研究结果显示，BBR较好的改善大鼠IR，调节糖耐量异常，恢复其动情周期，改善卵巢多囊状态及子宫腺肌症样表现的作用。

3.3 胰岛素抵抗与PPARs的相关性 PPARs与胰岛素抵抗有着密切的关系，是胰岛素增敏剂的作用靶点。噻唑烷二酮类可通过激活胰岛素受体亚单位上的酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，从而改善IR，降低胰岛素水平，提高PCOS患者排卵率，改善月经紊乱，增加妊娠机会[17]。目前，基于PPARs结构设计治疗胰岛素抵抗的西药主要是噻唑烷二酮类，但可引起肥胖、水肿，少量肝毒性等不良反应[18]，不能大量及长期用于临床。近年来，研究发现很多中药活性成分可以激活PPARs靶点，从而改善IR[19-20]，降低PPARγ单激动剂的副作用。本次实验显示，BBR可以通过调节PPARα、γ的表达，改善IR，进而改善大鼠的生殖功能。BBR治疗后，阴道涂片发现大鼠恢复了其规律的动情周期，高LH水平亦有明显降低，黄体数目增多，各级卵泡数目增多，子宫腺肌症样表现明显改善，大鼠整体内分泌功能趋于正常，进而使卵巢及子宫形态学趋于正常，使大鼠恢复规律的动情周期及排卵。BBR组与罗格列酮组相比INS和HOME-IR降低（P<0.05），说明BBR在改善IR的作用上优于罗格列酮。

综上所述，BBR可使子宫内膜PPARα、γ高表达，改善PCOS大鼠内分泌代谢异常，降低T及LH水平，改善大鼠内分泌失调状态及卵巢和子宫形态学结构，在改善IR方面优于罗格列酮。但其是通过哪种途径和机制调节PPARα、γ的仍需进一步研究。

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（收稿日期：2018-09-11）  （本文编辑：周亚杰）