QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产养殖环境沉积物中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素

钱卓真，汤水粉，梁 焱，位绍红，罗方方，陈 思

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.海南省环境科学研究院，海南 海口 570026)

磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素是人工合成的广谱类抗生素药物，被广泛应用于畜禽、水产养殖行业。据文献[1-3]报道，近年来，抗生素使用量呈现逐年上升趋势，在水产养殖环境中被频繁检出。该类抗生素进入水体环境的方式有两种：一是通过水产养殖直接投放方式进入水体环境[4]；另一种，借由现有水产养殖常采用塘头配套养猪或水面养鸭的养殖模式，通过畜禽粪便媒介间接进入水体环境[5]。该类药物在沉积物中性质稳定、半衰期较长、不易降解[6-8]，可对环境造成直接污染；还可能对沉积物中微生物的耐药性产生压力，诱导抗生素抗性基因和耐药性细菌的产生，从而产生严重的生态毒性[9-10]。此外，抗生素还可通过食物链蓄积作用进入人体，对人体器官产生蓄积毒性，危害人体健康。因此，近年来，抗生素的不当使用引起的环境污染和食品安全问题已成为研究热点。

目前，用于检测抗生素的方法有电化学法[11]、酶联免疫吸附法[12]、高效液相色谱法[13]、高效液相色谱-串联质谱法[14]、荧光偏振免疫分析法[15]等。其中，高效液相色谱-串联质谱法具有准确度高、重现性好等优点，是测定抗生素残留的主要检测方法。与高效液相色谱-串联质谱法结合的传统样品前处理方法主要是固相萃取法，但其步骤繁琐、耗时、费用较高。虽然近几年基于固相萃取法衍生出一系列样品处理方法，如：磁性固相萃取法[16-17]、分子印迹固相萃取法[18-19]、多壁碳纳米管固相萃取等[20-21]，但整体研究难度仍较大。2003年，Anastassiades等[22]报道了一种快速、简单、廉价、高效、安全的样品前处理技术，即QuEChERS方法，是全球检测水果、蔬菜中农残的标准样品处理方法。该方法已广泛应用于多种基质，如肉类、血液、酒，但将其应用于沉积物中抗生素残留测定的研究鲜有报道。

本工作拟以水产养殖环境中的沉积物为研究对象，通过考察提取溶剂、提取方法、吸附剂组成及配比对目标抗生素回收率的影响，建立QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱同时测定水产养殖环境沉积物中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素残留的分析方法，希望能为水产养殖环境中抗生素的有效管理和控制提供系统的理论依据和技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Ultra高效液相色谱-串联质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有电喷雾离子源；AB204-E型、PL203型电子分析天平：德国Mettler Toledo公司产品；DT5-5型低速台式离心机、GT16-3高速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司产品；MS3型旋涡混合器：德国IKA公司产品；KQ600DB超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；HSC-24B水浴氮吹仪：天津市恒奥科技发展有限公司产品；Milli-Q型超纯水仪：美国Millipore公司产品；FD8-6 冻干机：金西盟(北京)仪器有限公司产品；0.22 μm尼龙微孔滤膜：天津市津腾实验设备有限公司产品。

萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、盐酸克林霉素、克拉霉素、替米考星、泰乐菌素酒石酸盐标准品：纯度均大于98%，德国Dr Ehrenstorfer公司产品；交沙霉素标准品：纯度大于99%，欧洲药典EPCRS产品；三乙酸竹桃霉素、阿奇霉素二水合物、红霉素和罗红霉素标准品(纯度大于95%)，吉他霉素标准品(纯度大于92%)：均为德国Dr Ehrenstorfer公司产品。上述标准品均用甲醇配制成100 mg/L的标准储备液(称取的标准品质量按纯度修正过的质量)，再用甲醇配制成1 mg/L的26种抗生素标准混合液，将所配溶液于-20 ℃下避光保存。

甲醇、乙腈、甲酸：均为色谱纯，美国Tidea公司产品；乙酸铵、磷酸、二水合磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠：均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司产品；无水硫酸镁、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18：天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；超纯水：由Milli-Q型超纯水仪制备；磷酸盐缓冲液：2.72 g KH2PO4·2H2O与0.13 mL H3PO4混合，用超纯水定容至100 mL。

10个沉积物样品采自漳州的水产养殖区，包括泥质、泥沙、沙质3种类型，采样深度0～20 cm，每个样品约500 g。沉积物样品经冻干机干燥24 h后研磨，过80目筛，于4 ℃冰箱内保存。其中，沉积物样品的含水率为14.1%～47.2%，有机质含量为0.45%～2.11%。

1.2 样品前处理

称取(2±0.02) g试样于50 mL塑料离心管中，加入0.15 g Na2EDTA、20 mL乙腈-磷酸盐缓冲液(1∶1，V/V)，涡旋1 min，超声5 min，剧烈手摇2 min，再加入2 g NaCl继续手摇1 min，以4 000 r/min离心5 min；移取7～8 mL上清液于15 mL含0.25 g MgSO4、0.05 g C18、0.12 g PSA、0.01 g GCB的离心管中，涡旋1 min，手摇1 min，以3 000 r/min离心3 min，移取5 mL上清液，50 ℃氮吹至干。加入0.5 mL乙腈-水溶液(2∶8，V/V)，超声溶解，过0.22 μm滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 Ultimate XB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm×5 μm)；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样量20 μL；流动相：A为4 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸甲醇溶液；洗脱程序：0～5 min(10%～90%B)，5～9 min(90%～100%B)，9～10 min(100%～10%B)，10～15 min(10%B)。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源，正离子检测模式，雾化室加热温度220 ℃，喷雾电压3 500 V，鞘气压力367 kPa，辅助气流量5 mL/min，离子传输毛细管温度320 ℃，多反应监测模式(MRM)。母离子、子离子和碰撞能量列于表1。Q1半峰宽0.7 u，Q3半峰宽0.7 u，碰撞气(氩气)压力0.2 Pa。标准品多反应监测离子流色谱图示于图1。

表1 多反应监测母离子、子离子和碰撞能量Table 1 Parent ions, daughter ions and collision energy of MRM

注：*为定量碎片离子

图1 标准品多反应监测离子流色谱图(20 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solutions (20 μg/L)

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

大多数的QuEChERS采用乙腈、弱酸性缓冲液作为提取溶剂，实验在参考AOAC(Association of Official Analytical Chemists)2007.01官方QuEChERS和美国 EPA 推荐方法的基础上，考察了1%乙酸-乙腈溶液、McIlvaine缓冲液(pH 4.0)-乙腈和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 3.0)-乙腈的提取效果。结果表明：0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 3.0)-乙腈的提取效率最高，可同时提取3种类型的目标抗生素，且平均回收率在67.2%～112%之间，示于图2。由于抗生素与沉积物结合较紧密，单纯的涡旋方式无法有效提取沉积物中的抗生素。因此，本实验采用超声波辅助提取法[23]，利用超声波的空化、机械及热效应等来增强提取溶液分子的运动速度及穿透力，从而提高目标抗生素的提取效率。实验考察了1、2、5、7 min超声提取时间对目标抗生素的提取效果。结果表明，随着超声提取时间的延长，目标抗生素提取效率随之增大。当超声时间增至5 min时，目标抗生素的平均回收率趋于稳定；当超声时间延长至7 min时，目标抗生素的回收率无明显变化。为了保证提取效率，同时减少杂质干扰，最终选择5 min作为超声提取时间。另外，实验中还加入了NaCl，有助于分离提取液的乙腈层和水层。

2.2 净化条件的优化

沉积物样品中存在脂肪、色素、甾醇等杂质，要达到既能有效除去沉积物中杂质，又不会吸附目标物的目的，关键是吸附剂的选择。常见的QuEChERS吸附材料有MgSO4、PSA、C18、GCB等。作为传统的干燥剂，MgSO4用于去除有机溶剂残留的水，吸水放热过程可促进目标物的溶出[24]，且无水 MgSO4粒度较小，在振摇和涡旋过程中与样品的混合更加充分，并能与乙腈发生协同作用从而提高提取效率。PSA含有2个氨基，可有效吸附糖类、色素、脂肪酸和其他极性有机酸[25-27]，且PSA属于正相吸附剂，样品含水量越少净化效果越好，因此必须协调无水 MgSO4用量才能发挥较好的净化效果。C18含有十八烷基官能团，属于非极性吸附剂，可以吸附脂肪和一些矿物质[28]。GCB保留特殊的层状结构，能够吸附色素、甾醇等杂质[29]，但GCB容易吸附平面结构化合物，因此必须严控其用量。为了选择合适的吸附剂，实验考察了MgSO4(1.00、0.75、0.50、0.25 g)，PSA(0.20、0.15、0.12、0.10 g)，C18(0.15、0.10、0.05、0 g)，GCB(0.04、0.02、0.01、0 g)4 种吸附剂的不同用量对目标抗生素回收率的影响，结果分别示于图3。实验还考察了单种吸附剂和多种吸附剂共同净化下，目标抗生素回收率的变化，结果示于图4。

图2 不同提取溶剂对抗生素回收率的影响(n=3)Fig.2 Effects of the different extraction solvents on the recoveries of antibiotics (n=3)

实验结果表明：添加浓度为25 μg/kg水平时，采用单种吸附剂MgSO4、PSA、C18、GCB的净化效果不佳，因此选用MgSO4、PSA、C18、GCB混合吸附剂净化。随着PSA和C18用量的增加，回收率先升高后降低；随着MgSO4用量的增加，回收率急剧降低；在保证回收率(60%～120%)的基础上，加入少量GCB可有效去除提取液中的色素。综合考虑净化效果和方法回收率，最终确定0.25 g MgSO4、0.12 g PSA、0.05 g C18、0.01 g GCB作为混合净化吸附剂。

2.3 基质效应

应用液相色谱-质谱测定复杂基质样品时，基质共提物对目标物的离子化具有基质增强或基质抑制效应，从而影响目标物的定量测定。基质效应(matrix effects, ME)计算公式示于式(1)：

ME=(Sm-Sx)/Sx×100%

(1)

式中，Sm和Sx分别表示基质标准溶液曲线和溶剂标准溶液曲线的斜率。当ME<-50%或ME>50%，表示存在较强的基质抑制或增强效应；当-50%≤ME<-20%或50%≥ME>20%，表示存在中等的基质抑制或增强效应；当-20%≤ME≤20%，表示存在较弱的基质抑制或增强效应。

在最佳提取净化条件下，有13种目标物存在中等强度的基质效应，另外13种目标物存在较弱的基质效应，结果示于图5。这说明本实验优化的QuEChERS方法可有效消除沉积物中复杂的基质干扰物。

2.4 标准曲线、线性范围和定量限

为了消除基质效应带来的定量偏差[30]，采用基质匹配标准曲线法定量。移取适量的混合标准溶液，用空白沉积物样品提取液分别配制成不同质量浓度的基质标准溶液，目标物浓度分别为1.0、2.5、5.0、10、50、100、200 μg/L。以各组分浓度与其色谱峰面积进行线性回归，结果呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99。以10倍信噪比(S/N)计算定量限(limit of quantitation, LOQ)，具体数值列于表2。

2.5 方法准确度和精密度

以实际采集的养殖区泥质为研究对象进行标准添加实验，分别以低、中、高3个添加水平进行加标回收实验，每个浓度水平做6次平行实验，考察方法的准确度及精密度。结果表明：平均回收率在60.4%～113%，相对标准偏差为1.5%～13.6%。30天内，在25 μg/kg加标浓度下进行6次标准添加实验，考察方法的日间精密度，相对标准偏差为3.8%～11.5%，结果列于表2。该方法的精密度和准确度均能满足药物残留检测的需求。

注：a.PSA；b.C18；c.MgSO4；d.GCB图3 不同吸附剂加入量对抗生素回收率的影响(n=3)Fig.3 Effects of different mass of adsorbent on average recoveries of antibiotics (n=3)

图4 单种净化吸附剂与混合净化吸附剂的回收率对比(n=3)Fig.4 Comparison of recoveries of single purification adsorbent and mixed purification adsorbent (n=3)

图5 优化的净化条件下，抗生素的基质效应Fig.5 Matrix effects of antibiotics under optimum purification conditions

以泥质、泥沙、沙质3种类型的沉积物为研究对象，在25 μg/kg加标浓度下考察方法的适用性，回收率为63.2%～111%，相对标准偏差为4.5%～11.7%，结果列于表3。

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的方法对某养殖区的20个养殖池塘沉积物进行检测，结果列于表4。结果表明，所有沉积物样品中均能检出一定量的抗生素药物。其中，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、红霉素、罗红霉素、克拉霉素均有检出，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑的检出率较高，这与文献[1-5]的结果一致。磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑作为准用兽药，其使用频次较高、使用量也较大；它们可强吸附于沉积物上，难以降解，能够长时间稳定残留在沉积物基质中。

表2 线性方程、相关系数、定量限、平均回收率和日间精密度Table 2 Linear equations, correlation coefficents (R2), LODs, average recoveries and inter-day precisions

表3 不同类型沉积物样品的加标回收率的精密度(n=5)Table 3 Recoveries and precisions of different types of samples (n=5)

续表3

表4 水产养殖区沉积物样品中抗生素残留量Table 4 Residue of antibiotics in sediment samples from the aquaculture area

注：ND表示未检出或低于定量限

3 结论

通过优化QuEChERS方法的提取溶剂、提取方式、提取时间和净化材料，实现了基于高效液相色谱-串联质谱法高通量快速定性定量分析水产养殖环境沉积物中典型抗生素残留。该方法简单、快速，精密度、准确度和定量限均能满足沉积物中兽药残留的分析要求。同时可为养殖环境中药物的快速筛查平台奠定基础，为解决水产养殖行业生态防控、治理提供技术支持，有利于促进生态养殖、无公害养殖的持续发展。