大青叶化学成分及抗氧化活性研究

闫 峻，顾 娟，冯 硕，姬瑞芳，全庆华，刘永刚

(1.核工业北京地质研究院，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029；3.北京中医药大学，北京 100029)

大青叶(Isatidis Folium)是十字花科植物菘蓝的干燥叶，为临床常用中药，用于治疗温邪入营、高热神昏、发斑发疹、黄疸热痢、痄腮、喉痹、丹毒和痈肿等症状[1]。大青叶的化学成分主要包括吲哚类、喹唑酮类、芥子苷类、有机酸类和氨基酸类化合物等[2]，具有抗病原微生物、抗内毒素、抗炎、增强免疫、解热等药理活性[3]，是应用广泛的中成药的原料药之一。

目前，对中药及天然产物化学成分的分析主要采用溶剂分配和柱色谱法将其分离为单一化合物，然后用红外、紫外、核磁等化学方法对其结构进行鉴定，此方法费时，且无法对微量和痕量组分进行分析[4]。随着色谱、质谱及其联用技术的发展，特别是电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)等软电离质谱技术的发展，可同时完成成分分离和结构鉴定，是目前研究中药及天然产物化学成分的有效方法[5]。

现代研究表明[5]，自由基会损伤机体，与许多疾病的发生发展有着密切联系。传统的合成抗氧化剂虽然具有较强的抗氧化能力，但是长期服用会产生一定的毒性，甚至会致畸和致癌[5]。大青叶具有一定的抗氧化活性，目前对大青叶的研究主要集中在不饱和脂肪酸类和多糖类成分[6-7]，较少涉及抗氧化活性成分的研究。对抗氧化活性组分进行筛选，继而确定其中抗氧化活性的有效成分，对大青叶的物质基础研究具有重要意义。

本研究拟采用高效液相色谱-大气压化学电离质谱法(HPLC-APCI/MS)、高效液相色谱-电喷雾电离质谱法(HPLC-ESI/MS)和电喷雾多级串联质谱法(ESI-MS2)分别分析大青叶乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物的化学成分，同时，采用铁离子还原能力法(FRAP)对大青叶的抗氧化活性进行评价，并通过自由基清除法(DPPH)验证FRAP法的评价结果，以期为大青叶药效物质基础研究、质量控制标准的制订以及谱效关系的研究提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Waters 2695高效液相色谱仪：美国Waters公司产品；Finnigan LCQ离子阱质谱仪：美国Finnigan公司产品；自动酶标仪：奥地利CliniBio公司产品。

1.2 主要药材与试剂

大青叶药材：购于北京同仁堂长春药店，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为十字花科植物菘蓝的干燥叶；靛蓝和靛玉红对照品：中国药品生物制品检定所产品；吲哚-3-甲醛对照品：阿拉丁试剂(上海)有限公司产品；胞苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、腺苷、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和苹果酸对照品，以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪、抗坏血酸：均为美国Sigma公司产品；甲醇和乙酸：均为色谱纯，美国Fisher公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.3 样品制备

称取10 g大青叶药材，加水煎煮2次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩至适量，加入3倍量乙醇，搅匀，静置24 h，过滤，减压浓缩至稠膏状，得大青叶总提取物。向大青叶总提取物中加水使之溶解，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层减压浓缩并干燥，得大青叶乙酸乙酯提取物；用正丁醇萃取乙酸乙酯萃取后的水相部分，将正丁醇层减压浓缩并干燥，得大青叶正丁醇提取物；将正丁醇萃取后的水相部分干燥，然后加入95%乙醇溶解，减压抽滤，浓缩并干燥，得大青叶95%乙醇提取物。各取0.5 g大青叶乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物，分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取滤液，待测。

1.4 仪器条件

1.4.1大青叶乙酸乙酯提取物化学成分的色谱和质谱条件 色谱条件：色谱柱为Kromasil C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为0.15%乙酸/水(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～45 min(40%～100%B)，45～60 min(100%B)；流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。质谱条件：大气压化学电离源，正、负离子模式检测；质量扫描范围m/z50～1 000；气化温度450 ℃；毛细管温度150 ℃；喷雾电压4.0 kV；鞘气(N2)流速0.9 L/min；辅助气(N2)流速1.5 L/min。

1.4.2大青叶正丁醇提取物化学成分的色谱和质谱条件 色谱条件：色谱柱为Kromasil C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为0.15%乙酸/水(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～10 min(5%B)，10～20 min(5%～20%B)，20～30 min(20%～30%B)，30～50 min(30%～35%B)，50～65 min(35%～55%B)；流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；检测波长265 nm。质谱条件：电喷雾电离源，正、负离子模式检测；质量扫描范围m/z50～1 000；毛细管温度250 ℃；喷雾电压4.5 kV；鞘气(N2)流速0.9 L/min；辅助气(N2)流速3.0 L/min。

1.4.3大青叶95%乙醇提取物化学成分的质谱条件 电喷雾电离源，正、负离子模式检测；质量扫描范围m/z50～1 000；毛细管温度200 ℃；喷雾电压4.5 kV；鞘气(N2)流速0.75 L/min；将大青叶95%乙醇提取物加甲醇稀释后，采用流动注射泵进样，进样流速5 μL/min。

1.5 大青叶抗氧化活性研究

1.5.1铁离子还原能力法 分别用甲醇稀释大青叶乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物，配制成0.1 g/L待测样品溶液，将抗坏血酸(Vc)对照品配制成500 μmol/L甲醇溶液作为对照品溶液。将300 mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH 3.6)，10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液(溶解在40 mmol/L HCl中)和20 mmol/L三氯化铁溶液，以体积比10∶1∶1混合，配制成FRAP试剂。取10 μL Vc对照品溶液或待测样品溶液，加入96孔板中，然后迅速加入300 μL FRAP试剂，37 ℃下用自动酶标仪分别测定0 min和4 min Vc对照品溶液和待测样品溶液的吸光度值，平行测定3次。FRAP法的测量结果以相当于500 μmol Vc的抗氧化能力计算，其计算公式为：

FRAP(μmol/L)=(0 min吸光度-
4 min吸光度)/(0 min Vc吸光度-
4 min Vc吸光度)×500×2

(1)

1.5.2自由基清除能力法 将大青叶乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物分别用甲醇稀释，在0.001～10 g/L内配制成10个不同浓度的待测样品溶液。用甲醇将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配制成65 μmol/L的DPPH溶液。将20 μL甲醇和100 μL DPPH溶液混合为A0，20 μL不同浓度待测样品溶液和100 μL DPPH溶液混合为Ai，20 μL不同浓度待测样品溶液和100 μL甲醇混合为Aj。将以上3种混合溶液避光放置30 min，用自动酶标仪在515 nm波长下分别测定其吸光度值，每个样品平行测定3次，计算不同浓度样品对DPPH自由基的清除率，计算公式为：

SA(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(2)

以清除率对各样品的浓度做标准曲线，得线性回归方程SA=aC+b，依此可以计算出清除率为50%时的样品浓度(C)，即为该样品的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 大青叶各提取物的化学成分分析

大青叶乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的总离子流图分别示于图1、图2。大青叶95%乙醇提取物的一级全扫描电喷雾质谱图示于图3。

大青叶乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物化学成分的LC-MS2数据及其解析、对应的化合物分别列于表1、表2。

注：a.高效液相色谱图；b.正离子模式；c.负离子模式图1 大青叶乙酸乙酯提取物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of the acetate extract from Isatidis Folium

注：a.高效液相色谱图；b.正离子模式；c.负离子模式图2 大青叶正丁醇提取物的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of the n-BuOH extract from Isatidis Folium

注：a.正离子模式；b.负离子模式图3 大青叶95%乙醇提取物的一级全扫描质谱图Fig.3 Mass spectra of the 95% ethanol extract from Isatidis Folium

序号No.保留时间tR/min正离子模式Positive ion mode(m/z)负离子模式Negative ion mode(m/z)二级质谱数据MS2 data化合物Compounds110.45166[M+H]+166:148[M+H-H2O]+,120[M+H-HCOOH]+N-醛基氨基苯甲酸210.98267[M+H]+267:249[M+H-H2O]+,239[M+H-CO]+,146[M+H-C6H5COOH]+3-羧基苯基喹唑酮312.91137[M-H]-137:93[M-H-CO2]-水杨酸413.40146[M+H]+146:118[M+H-CO]+3-醛基吲哚513.84239[M+H]+239:221[M+H-H2O]+,211[M+H-CO]+3-羟苯基喹唑酮615.81327[M+H]+327:201[M+H-CH3CHC(COOH)COCH2]+依靛蓝酮723.63249[M+H]+249:221[M+H-CO]+色胺酮828.28263[M+H]+263:235[M+H-CO]+,219[M-H-CO2]+靛蓝934.25263[M+H]+263:235[M+H-CO]+,219[M-H-CO2]+靛玉红1037.44279[M+H]+279:223[M+H-2CO]+,205[M+H-2CO-H2O]+羟基靛玉红1146.39277[M-H]-277:259[M-H-H2O]-,233[M-H-CO2],217[M-H-CH3COOH]-亚麻酸1259.33535[M+H]+535:507[M-H-CO]+,463[M+H-C3H4O2]+,435[M+H-C3H4O2-CO]+焦脱镁叶绿酸a

表2 大青叶正丁醇提取物的LC-MS2数据Table 2 LC-MS2 data of the n-BuOH extract from Isatidis Folium

由图3可知，大青叶95%乙醇提取物在正离子模式下主要有m/z104、116、130、175、180、266、337、365和381离子，在负离子模式下主要有m/z133、341和377离子。

大青叶95%乙醇提取物化学成分ESI-MS2数据及其解析、对应的化合物列于表3。

表3 大青叶95%乙醇提取物的ESI-MS2数据Table 3 ESI-MS2 data of the 95% ethanol extract from Isatidis Folium

在正离子模式下，m/z104离子的MS2谱中有m/z86[M+H-H2O]+和m/z60[M+H-CO2]+碎片离子，根据质谱裂解规律，结合文献[13]，推断其为γ-氨基丁酸；m/z116离子的MS2谱中有m/z70[M+H-HCOOH]+碎片离子，与脯氨酸对照品具有相同的质谱裂解规律，确定其为脯氨酸；m/z130离子的MS2谱中有m/z113[M+H-NH3]+、m/z84[M+H-SCH2]+和m/z70[M+H-SC2H4]+碎片离子，根据质谱裂解规律，推断其为表告依春；m/z175离子的MS2谱中有m/z157[M+H-H2O]+、m/z140[M+H-H2O-NH3]+和m/z112[M+H-HCOOC-NH3]+碎片离子，与精氨酸对照品具有相同的裂解规律，可以确定其为精氨酸；m/z180离子的MS2谱中有m/z162[M+H-H2O]+、m/z144[M+H-2H2O]+、m/z84[M+H-2H2O-C2H4O2]+和m/z72[M+H-H2O-C3H6O3]+碎片离子，根据文献[13-14]报道，确定其为氨基葡萄糖；m/z365和m/z381在一级全扫描质谱中的质荷比相差16，初步判断其可能分别为蔗糖的[M+Na]+和[M+K]+峰，其中m/z365的MS2谱中有m/z203[M+Na-glc]+和m/z185[M+Na-glc-H2O]+碎片离子，m/z381的MS2谱中有m/z219[M+K-glc]+和m/z201[M+K-glc-H2O]+碎片离子，根据文献报道[15-16]，确定其为蔗糖。

在负离子模式下，m/z133的MS2谱中有m/z115[M-H-H2O]-碎片离子，与苹果酸对照品具有相同的质谱裂解规律，同时结合文献[17]报道，确定其为苹果酸；m/z341的MS2谱中有m/z281[M-H-C2H4O2]-、m/z179[M-H-glc]-和m/z161[M-H-H2O]-碎片离子，与正离子模式下的m/z365、381离子相对应，为蔗糖的[M-H]-峰[15-16]；m/z191的MS2谱中有m/z173[M-H-H2O]-和m/z111[M-H-2H2O-CO2]-碎片离子，与柠檬酸对照品具有相同的质谱裂解规律，可以确定其为柠檬酸；m/z195离子在MS2中产生m/z177[M-H-H2O]-、m/z159[M-H-2H2O]-、m/z129[M-H-2H2O-CH2O]-和m/z99[M-H-2H2O-2CH2O]-碎片离子，根据文献[13-14]报道，确定该化合物为葡萄糖醛酸。

2.2 大青叶抗氧化活性的研究

FRAP值的大小可以反映样品对铁离子还原能力的强弱，FRAP值越大，说明该样品对铁离子的还原能力越强，即其抗氧化活性越强，反之越弱。样品的IC50值可以反映该样品对DPPH自由基清除能力的强弱，IC50值越小，表明该样品对DPPH自由基的清除能力越强，即其抗氧化能力越强，反之越弱[4,18]。大青叶乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和总提取物的抗氧化活性结果列于表4。大青叶不同化学组分抗氧化活性强弱依次为：大青叶乙酸乙酯提取物>总提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物。大青叶乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最强，高于总提取物，表明大青叶抗氧化活性的有效成分主要集中在极性较低的化学组分中。

表4 大青叶提取物的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of Isatidis Folium

3 结论

本研究采用液相色谱-质谱联用技术分析大青叶乙酸乙酯、正丁醇提取物的化学成分，采用电喷雾多级质谱技术分析大青叶95%乙醇提取物的化学成分。从大青叶乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇提取物中共鉴别出39种化合物，其中包括6种有机酸类化合物，8种生物碱类化合物，6种核苷嘌呤类化合物，4种氨基酸类化合物，11种黄酮类化合物，2种糖类化合物，1种卟啉类化合物，1种含硫类化合物。

大青叶抗氧化活性评价结果表明，大青叶抗氧化活性成分主要集中在极性较低的化学组分中，其主要有效成分为吲哚类、喹唑酮类和有机酸类化合物，糖类和氨基酸类化合物的抗氧化活性较弱。本研究结果可为大青叶药效物质基础研究、质量控制标准的制订和谱效关系的研究提供理论依据。