苗药酢浆草药材的质量标准研究Δ

2019-08-15马雪吴莹莹贺亚都王广成潘洁张宝李勇军

中国药房 2019年15期

马雪，吴莹莹，贺亚都，王广成，潘洁，张宝，李勇军#

（1.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳 550004；2.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵阳 550004；3.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；4.贵州维康子帆药业股份有限公司，贵阳 550004）

苗药酢浆草（苗名Suaib mib mib）为酢浆草科植物酢浆草（Oxalis corniculataL.）的新鲜或干燥全草，始载于《本草纲目》，又名酸浆草、三叶酸、斑鸠酸，在我国主要分布于华北、华中、华南、江西、云南、四川等地，尤其在贵州资源丰富[1]。酢浆草收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中[2]，为贵州省苗族常用药材，具有清热解毒、消肿散疾、补肺泻肝、健胃止咳、凉血化瘀等功效，在苗族民间常用于治疗泄泻、痢疾、黄疸、淋病、疥癣、痔疾、跌打损伤等症[3-5]。现代药理研究表明，酢浆草具有较好的抗炎、抗病毒、抑菌和抗氧化作用[6-9]。化学研究方面，从酢浆草中分离得到的化合物有黄酮类、鞣质类、植物甾醇类、酚类、糖苷类、脂肪酸类以及挥发油类等[10-15]。李胜华等[16]从酢浆草中分离得到了异牡荆苷，并通过对酢浆草的主要化学成分进行分析研究，发现异牡荆苷为其主要代表性黄酮类化合物。

目前，含有酢浆草药材的主要制剂有泌淋胶囊、泌淋颗粒、泌淋清胶囊、妇炎消胶囊、六味伤复宁酊、肿痛舒喷雾剂、骨康胶囊等，应用较广。但在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中，酢浆草质量标准项下仅有性状描述及薄层色谱鉴别试验，其质量标准简单，且薄层色谱鉴别方法烦琐，展开剂中的苯具有毒性，不能满足中药现代的质量控制要求。而中药的质量又将直接影响中医的临床疗效及用药安全。为确保酢浆草药材质量，本研究将通过鉴别研究、浸出物及含量测定等，为其质量标准的提升提供试验依据，进而为酢浆草药材的质量控制和进一步深度开发该药用资源提供参考。

1 材料

1.1 仪器

50i显微镜、DS-Fi2显微成像系统（日本尼康公司）；REPROSTAR3薄层数码成像系统（瑞士卡玛公司）；UltiMate 3000高效液相色谱仪（包括系统控制器、低压梯度组件、温控样品室、LPG-3400SD输液泵、SR-3000 Solvent Rack脱气组件、WPS-3000SLANAL YTICAL自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、ΜV-VIS检测器及Chromeleon色谱数据工作站）购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 药品与试剂

12批酢浆草药材收集自贵州、安徽、云南和河南4个省份，由贵州医科大学药学院标本馆龙庆德副教授鉴定其为O.corniculataL.的新鲜或干燥全草；酢浆草对照药材（批号：181126）、异牡荆苷对照品（批号：170904，纯度：98.47%）均购自成都植标化纯生物技术有限公司；薄层色谱硅胶G板（青岛海洋化工有限公司，批号：20180115）；所有试剂均为分析纯。酢浆草药材来源见表1。

表1 酢浆草药材来源Tab 1 Source of O.corniculata

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 显微鉴别通过对12批酢浆草药材样品的粉末进行观察和测量，其显微鉴别特征总结如下：本品粉末呈灰褐色至黄褐色。非腺毛甚多，主要为单细胞，先端尖，壁厚，具疣状突起；还可见另一种非腺毛，先端钝圆，壁薄光滑。草酸钙方晶在茎薄壁细胞中，呈方形，直径3～20 μm。纤维纹孔明显，壁厚，直径5～32 μm。导管为螺纹导管、梯纹导管及具缘纹孔导管。表皮细胞呈多边形或不规则形，排列紧密，可见椭圆形气孔。酢浆草药材粉末显微鉴别图见图1。

图1 酢浆草药材粉末显微鉴别图Fig 1 Microscopic characteristics of O.corniculata powder

2.1.2 薄层色谱鉴别取各批次酢浆草药材样品粉末（过二号筛）0.5 g，加甲醇10 mL，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取酢浆草对照药材粉末0.5 g，同法制成对照药材溶液。照2015年版《中国药典》（四部）通则0502法[17]进行薄层色谱试验。吸取上述溶液各5µL，分别点于硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（波长365 nm）下检视。结果，在供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。酢浆草药材的薄层色谱图见图2。

图2 酢浆草药材的薄层色谱图Fig 2 TLC chromatograms of O.corniculata

2.2 检查

2.2.1 水分含量测定精密称取各批次酢浆草药材粉末（过二号筛）约2 g，照2015年版《中国药典》（四部）通则0832中第二法——烘干法[17]进行水分测定，并计算样品中含水量。结果，12批酢浆草水分含量在6.66%～12.13%之间，详见表2。

表2 酢浆草药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物含量测定结果（n＝3，%%）Tab 2 Results of content determination of moisture，total ash，acid insoluble ash and ethanol extract in O.corniculata（n＝3，%%）

2.2.2 总灰分和酸不溶性灰分含量测定精密称取各批次酢浆草药材粉末（过二号筛）约3 g，照2015年版《中国药典》（四部）通则2302中灰分测定法[17]测定样品中总灰分及酸不溶性灰分含量。结果，12批酢浆草药材中总灰分含量为9.16%～13.79%，酸不溶性灰分含量为1.58%～4.63%，详见表2。

2.3 醇溶性浸出物含量测定

因酢浆草的醇提物中含有较高的黄酮类成分[18]。此外，民间亦用其泡酒，具有凉血消肿、解毒散瘀的功效，根据酢浆草的主要化学成分及使用习惯，选择研究其醇溶性浸出物。分别取各批次酢浆草药材粉末（过二号筛）约2.0 g，照2015年版《中国药典》（四部）通则2201浸出物测定法项下热浸法[17]进行测定，采用乙醇为溶剂。结果，12批次酢浆草醇溶性浸出物含量在5.22%～15.79%之间，详见表2。

2.4 异牡荆苷含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备取酢浆草药材粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。

2.4.2 对照品溶液的制备取异牡荆苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL含异牡荆苷0.521 9 mg的溶液，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取对照品溶液贮备液适量，制备成质量浓度为26.1 μg/mL的对照品溶液。

2.4.3 色谱条件与系统适用性试验色谱柱为Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）；流速为1 mL/min；色谱柱温为35℃；检测波长为338 nm；进样量为10 μL。分别取“2.4.1”供试品溶液和“2.4.2”对照品溶液，按此色谱条件进样分析。结果，各色谱峰分离良好，异牡荆苷与相邻峰间的分离度＞1.5，理论板数以异牡荆苷计不低于5 000。高效液相色谱图见图3。

图3 高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms

2.4.4 线性关系考察分别精密量取对照品贮备液适量，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度分别为5.20、10.4、26.1、52.2、78.3 μg/mL的系列对照品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制工作曲线，进行回归处理，得到回归方程为y＝573.18x－0.031 9（r＝0.999 0）。结果表明，异牡荆苷质量浓度在5.20～78.3 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.4.5 耐用性试验取酢浆草药材（批号：20160924）粉末1 g，精密称定，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，分别考察在不同流动相比例[乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V）]，不同pH溶液[乙腈-0.05%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.15%磷酸溶液（15∶85，V/V）]，不同色谱柱[（Puls C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同柱温（35、35、38℃）以及不同仪器[UlMate 3000（双三元）、UlMate3000、岛津Prominence LC-20A]下系统的耐用性，每个条件分别测定3份样品，记录色谱图并计算不同条件下酢浆草药材样品溶液中异牡荆苷的含量。结果显示，在不同试验条件下酢浆草药材样品溶液中异牡荆苷含量的RSD均＜2.0%（n＝9），表明该方法耐用性良好。

2.4.6 精密度试验（1）重复性试验：分别取酢浆草药材（批号：20160924）粉末0.5 、1、1.5 g，各3份，精密称定，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，并计算不同质量浓度的酢浆草药材样品溶液中异牡荆苷的含量。结果，3个不同质量浓度样品溶液中异牡荆苷的平均含量为0.037%（按干燥品计），RSD为1.3%（n＝9），表明该方法重复性良好。（2）中间精密度试验：以不同的实验人（2名），在不同时间按上述方法分别取酢浆草药材（批号：20160924）粉末1 g，各3份，精密称定，按“2.4.1”项下制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，异牡荆苷峰面积的RSD为0.019%（n＝6），表明方法的中间精密度良好。

2.4.7 稳定性试验取同一供试品溶液（批号：201609-24），分别在室温放置0、1、2、4、8、24 h后，按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，异牡荆苷峰面积的RSD为0.50%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.8 加样回收率试验取已知含量的酢浆草药材（批号：20160924）粉末0.5 g，精密称定，共6份，按称量样品中被测定成分的本底含量值加入异牡荆苷对照品，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算回收率。结果，异牡荆苷的平均回收率为98.67%，RSD为0.74%（n＝6），表明该方法准确度良好。回收率试验结果见表3。

表3 回收率试验结果Tab 3 Results of recovery tests

2.4.9 样品含量测定分别取各批次酢浆草药材粉末约1 g，精密称定，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.4.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图并计算各批次酢浆草中异牡荆苷的含量。结果，12批酢浆草药材中异牡荆苷含量在0.036%～0.144%之间，详见表4。

表4 12批酢浆草中异牡荆苷含量测定结果（n＝3，%%）Tab 4 Results of content determination of isovitexin in 12 batches of O.corniculata（n＝3，%%）

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别方法的改进

2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中苗药酢浆草薄层色谱鉴别项下的供试品溶液制备方法为：“取本品粉末3 g，加水10 mL，用盐酸调pH至2～3，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液用等量乙醚萃取，分取醚层，挥至约1 mL，作为供试品溶液。”该操作较为复杂，包括调节pH、加热回流、萃取等步骤；且展开剂为苯-甲醇-醋酸（45∶8∶4，V/V/V），使用具有强毒性的试剂苯，且使用量较大。其次，对照药材每次试验需3 g样品，购买的规格一般为1 g/瓶，从经济成本上考虑，该方法消耗较大。在本研究中，笔者将供试品溶液制备方法修改为：分别取供试品和对照药材粉末各0.5 g，甲醇超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液，并以三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂。该方法具有操作简便，避免使用强毒性试剂苯，节约成本等优点，且所得薄层斑点清晰、分离度良好。