原发性干燥综合征血清miR-146a与炎症因子的相关性

王笑颜，纪鹏天，辛少军，邵圣文

作者单位:313000 浙江湖州，湖州中心医院检验科免疫室(王笑颜、辛少军)，肿瘤介入科(纪鹏天)；313000 浙江湖州，湖州师范学院微生物与免疫学教研室(邵圣文)

原发性干燥综合征(primary Sjögren's syndrome，pSS) 是一种进展缓慢的自身免疫性疾病，其特征表现为唾液腺和泪腺的进行性破坏，导致唾液和泪液分泌减少，出现口腔黏膜及眼结膜干燥，并可累及肺、肾脏、肝脏以及血管等多个脏器。pSS 是风湿科第二大疾病，患者发病年龄大多介于40～60 岁，成人患病率为0.5%～1%，女性发病占90%以上[1-2]。pSS 病因至今不清，目前研究认为病毒、激素、遗传和环境因素与pSS 发病和进展有关[3-4]。pSS 发病机制主要是由于免疫功能紊乱引起，有报道称各种细胞因子与自身免疫病密切相关。近年来，微小RNA (microRNA，miRNA) 调节免疫系统的作用逐渐受到重视，可能与各种自身免疫性疾病的发生、发展有关。已有不少文献报道与pSS 相关的miRNA[5-7]。

本研究通过检测pSS 患者活动期和稳定期miR-146a的相对表达量、细胞因子IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的变化，旨在分析pSS 患者血清miR-146a 与细胞因子的相关性，为miR-146a 参与pSS发病的机制提供依据，进而为miR-146a 用于诊断pSS 活动期以及监测pSS 预后提供依据。

1 对象与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月至2018年9月湖州市中心医院风湿免疫科pSS 患者42 例，均为女性住院或专科门诊患者，年龄为21～63 岁，平均年龄为(40±12) 岁。pSS 患者的病程、血沉(ESR)、C 反应蛋白(CRP)、IgG 抗体、IgA 抗体、IgM 抗体和自身抗体等相关数据及疾病的受累情况见表1。依据干燥综合征疾病活动指数 (SSDAI) 对pSS组患者进行筛查，分为pSS 活动期组(SSDAI≥5分) 20 例，pSS 稳定期组(SSDAI＜5 分) 22 例。符合2002年美国-欧洲分类诊断标准(American-European Consensus Criteria，AECC)[8-9]。诊断标准:(1) 口干症状；(2) 眼干症状；(3) 口干体征，方糖试验30 min 内未融化；(4) 眼干体征，施墨试验≤5 mm/5 min；(5) 唇腺活检至少有1 个淋巴细胞浸润灶；(6) 血清学检查，类风湿因子、抗SS-A、抗SS-B 抗体至少有1 项为阳性；(7) 无类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病等其他自身免疫性疾病。初诊组患者为以上6 项中(5)、(6) 均为阳性，而其余4 项中至少2 项为阳性。pSS 患者的选择依据不并发其他自身免疫性疾病，遗传性疾病，口眼客观检查有干燥现象，排除其他可以引起口眼干燥的情况。且下唇腺活检显示所有患者均存在腺体萎缩及灶性淋巴细胞浸润。另选择本院同期体检的40 例健康女性志愿者为正常对照组，年龄为20 ～65 岁，平均年龄为(42.5±14) 岁。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂:人Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit (Cat.55000) (加 拿 大Norgen 公 司)，miRNA 反转录试剂盒、miRNA 荧光定量PCR 试剂盒等(开源基因公司)，miR-146a 引物(开源基因公司)，IL-17 试剂盒(北京华英生物技术研究所公司)。IL-6 和TNF-α 试剂盒(北京东雅生物技术研究所)。

1.2.2 仪器:ABIPRISM® 7900HT 型荧光定量PCR 仪，Uranus AE150 全自动酶免仪。

1.3 方法

1.3.1 样本采集:每例患者和健康对照者采集外周静脉血4 mL 至凝胶分离试管，3 500 r/min 离心15 min取上清，采用总RNA 提取试剂盒提取总RNA，-70 ℃保存。

1.3.2 实时荧光定量PCR (qPCR) 检测miR-146a:取健康对照组和pSS 患者组总RNA 进行逆转录，以U6 作为内参照。逆转录反应体系为10 μl，总RNA 样品量为5 μl，加入随机引物和逆转录酶，反应后得到cDNA。qPCR 反应进行40 个循环:95 ℃10 s，60 ℃20 s，70 ℃10 s。qPCR 反应体系:荧光染料9 μl、cDNA 模板2 μl、正链引物2 μl、反链引物2 μl、加水至总体积20 μl，复孔为3 个。ABI 7500RT-PCR 仪检测，数据采用2-△△Ct法分析。

1.3.3 血清IL-17、IL-6、TNF-α 测定:无菌抽取外周静脉血4 ml 加入含有凝胶的试管，于留取标本后30 min 内，3 500 r/min离心15 min 用移液器将上清移入1 ml的EP 管中，-20 ℃冰箱中冻存待用。按试剂说明书要求，采用ELISA 酶联免疫法检测。

1.3.4 活动期和稳定期pSS 患者miR-146a 相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α 的相关性分析:采用Pearson 相关性和回归分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS23.0 软件进行统计分析，miR-146a定量检测结果换算成2-ΔCt，用相对表达量表示。采用Kolmogorov-Smirnov 检验法作数据正态性检验，对于符合正态分布的数据，两组间均值差异比较采用t检验，配对组间均值差异比较采用t检验。pSS 患者稳定组和活动组miR-146a 的含量与IL-17、IL-6 和TNF-α 的相关性分析采用Pearson 相关性分析，采用一元线性回归法对miR-146a 相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α 水平进行回归分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组pSS 患者一般资料比较

pSS 活动组和稳定组比较，病程较长 (P＜0.163)，ESR 快(P＜0.05)，CRP 炎症指标偏高(P＜0.05)，活动组口干、猖獗齿、关节炎和腮腺肿大均较稳定组受累人数多(P＜0.05)，可能与疾病活动有关，差异有统计学意义。其余指标两组间差异无统计学意义(表1)。

2.2 pSS 稳定组、pSS 活动组和对照组miR-146a相对表达量及血清细胞因子含量比较

pSS 活动组血清miR-146 a 的相对表达量、IL-17、IL-6 和TNF-α 的含量均高于稳定组和对照组(P＜0.05)；pSS 稳定组各指标的表达量高于对照组(P＜0.05) (表2)。

2.3 pSS 患者稳定组和活动组miR-146a 相对表达量与血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的相关性分析

pSS 患者稳定组和活动组miR-146a 的表达水平与IL-17、IL-6 和TNF-α 含量均呈正相关(r＝0.720、0.798、0.644，P＜0.001)。

表1 pSS 稳定组患者和pSS 活动组患者的一般资料Table 1 General materials of stable group and active group of pSS

表2 pSS 稳定组和活动组与健康对照组miR-146a 相对表达量及血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量比较(±s)Table 2 Comparison of expression of the relative miR-146a and serum IL-17，IL-6，and TNF-α level in and active pSS stable and healthy control group ( ±s)

表2 pSS 稳定组和活动组与健康对照组miR-146a 相对表达量及血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量比较(±s)Table 2 Comparison of expression of the relative miR-146a and serum IL-17，IL-6，and TNF-α level in and active pSS stable and healthy control group ( ±s)

*稳定组vs 对照组P＜0.05；**活动组vs 对照组P＜0.05；△活动组vs 稳定组P＜0.05

组别 例数 miR-146a IL-17 (μg/L) IL-6 (μg/L) TNF-α (μg/L)对照组 40 5.24±0.88 49.05±8.55 44.22±10.78 80.76±16.33稳定组 22 18.63±7.07* 96.47±19.92* 93.16±12.56* 151.37±38.55*活动组 20 44.71±18.39**△ 128.14±13.60**△ 128.19±13.09**△ 172.19±34.31**△

2.4 miR-146a 相对表达量与血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的一元线性回归分析

以miR-146a 为自变量，以IL-17、IL-6 和TNF-α含量为因变量，进行一元线性回归分析，结果显示miR-146a 相对表达量越高，IL-17、IL-6 和TNF-α含量也越高(P＜0.05) (表3)。

表3 miR-146a 相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α含量的一元线性回归分析Table 3 Univariate linear regression analysis of the relative expression of miR-146a and the contents of IL-17，IL-6，and TNF-α

3 讨论

干燥综合征是一种主要累及泪腺和唾液腺等外分泌腺的系统性自身免疫性疾病，表现为泪腺和唾液腺的进行性破坏，导致泪腺和唾液腺分泌减少，导致口腔黏膜和眼结膜干燥。病变局限在泪腺和唾液腺，则称为原发性pSS，伴有其他自身免疫病则称为继发性SS。SS 患者男女之比1 ∶9。目前发病机制还不明确，可能与免疫、病毒、遗传、激素等因素有关。近些年miRNA 和免疫相关因子的异常表达在这些因素中所起的作用越来越受到关注。

本研究发现，pSS 稳定组和活动组患者血清miR-146a 相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α 含量均明显高于对照组(P＜0.05)，提示miR-146a、IL-17、IL-6 和TNF-α 都可能参与了pSS 疾病的发生发展。Pauley 等[10]研究发现，在8 和20 周自发干燥综合征小鼠外周单核细胞中，miR-146a 的表达均显著升高。研究显示SS 患者外周血miR-146a与对照组相比提高了7.9 倍。以上的表达差异是诊断性miRNA 探针研发的理论基础，SS 在细胞免疫方面的研究罕见报道。Zilahi 等[11]研究发现，SS患者与健康对照组相比，PBMCs 中miR-146a 及其靶基因TRAF6 过度表达，而另一靶基因IRAK1 的表达显著下降。本试验pSS 患者组miR-146a 表达量升高的结论与 Pauley 和 Zilahi 研究一致。Taganov 等[12]研究发现，pSS 患者miR-146a 的靶基因是IRAK-1 和TRAF-6，这两种炎症反应中重要的信号分子由TLR7 (TOLL-like receptor 7) 和TLR9(TOLL-like receptor 9) 所介导，这两个基因经常被认为是炎症信号途径中的重要靶基因。激活信号途径中的TLR 和其配体MyD88 (myeloid differentiation factor 88) 能够引起IRAK 磷酸化，并激活TRAF-6，形成MyD88-IRAK1-TRAF6 复合体，这条通路能够激活JNK 和NF-κB 信号通路，而NF-κB信号通路能够调整TNF-α 和IL-1β[13].在TLR 激活NF-κB 信号通路的同时，TRAF6 也介导了MyD88依赖和非依赖信号通路，通过TRAF6 介导，调节下游信号通路，进而调节TNF-α 的分泌。但miR-146a 的升高为何不能很好地抑制过度的免疫炎症反应，有学者认为miR-146a 与靶基因结合后功能缺陷，导致其不能发挥抑制免疫炎症的作用，使体内TNF-α 表达持续升高。

CD4＋表达的Th17 细胞在pSS 中发挥重要作用[14]，通过分泌IL-17、IL-6 等细胞因子，加剧促炎症反应，长期的慢性炎症反应导致患者外分泌腺大面积受累，出现口干、眼干以及腺体肿胀等临床症状。研究发现，IL-17 是唾液腺功能受损的重要炎症因子[15]。Ciccia 等[16]发现，在pSS 患者炎症浸润的唾液腺中，IL-17、IL-22、IL-23 及其mRNA水平明显上调，信号转导子和转录激活子3 mRNA与络氨酸磷酸化相关蛋白水平在pSS 患者体内也明显上调，表明IL-17 和miR-146a 可能在pSS 的促炎症反应过程中发挥关键性作用。Lin 等[17]发现在一些野生型小鼠体内注射Th17 细胞后，小鼠出现了与pSS 相似的临床症状。以上研究充分证明了IL-17对pSS 的发病有一定的促进作用。

同时研究发现IL-6 是反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要标志物。本研究发现pSS 活动期组IL-6 含量比对照组高，说明IL-6 参与了疾病的发生，IL-6 的升高预示着pSS 患者的疾病预后不良。Roescher 等[18]研究发现TNF-α、IL-1β 高表达于干燥综合征患者和实验动物外周血及颌下腺中。研究者分析TNF-α 不但调控多种细胞因子的分泌，促进B、T 淋巴细胞产生抗体，引起炎症反应，还可单独与IFN-γ 一起诱导细胞凋亡，引起唾液腺细胞分泌障碍，因此TNF-α 可能是pSS 一个关键的致病细胞因子。

本研究中pSS 活动组的miR-146a、IL-17、IL-6和TNF-α 表达量与pSS 稳定组和对照组比较明显增高(P＜0.05)，pSS 稳定组和对照组比较亦增高明显(P＜0.05)，且miR-146a 的相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α 含量有明显相关性，进一步证实pSS 与TNF-α 等细胞因子异常密切相关。TNF-α 的表达增多对pSS 的发生发展有着重要影响，并与其疾病活动性密切相关[19]，本研究结果与其一致。

本研究显示miR-146a 的相对表达量与IL-17、IL-6 和TNF-α 呈正相关，回归分析结果显示miR-146a 水平越高，IL-17、IL-6 和TNF-α 水平也越高(P＜0.05)，提示miR-146a 表达量可预测IL-17、IL-6 和TNF-α 水平，进一步说明它们之间存在着某种依赖性。miR-146a 是天然免疫和获得性免疫的重要调控因子[20]，其机制可能是miR-146a 的过表达激活了靶基因TRAF-6，促使TNF-α 分泌增加；miR-146a 的含量增加促使Th17 细胞激活，从而导致IL-17、IL-6 分泌增多，引起全身自身免疫反应；也可能是miR-146a 与IL-17 和IL-6 及TNF-α共同作用于pSS 患者促使疾病的发生发展。