一测多评法同时测定竭红跌打酊中5种成分的含量

赵 华，茅建辉

0 引言

竭红跌打酊处方源于卫生部颁药品标准中药成方制剂第十四册，是由红花、儿茶、苏木、当归尾、白矾等10味中药材提取加工而成的中成药复方制剂，具有散瘀消肿、活络止痛的功效，主要用于跌伤、筋骨扭伤、积瘀肿痛等病症的治疗[1]。现行质量标准未对竭红跌打酊方中任何成分进行定量测定，也未检索到对该制剂进行含量测定的文献报道。随着国家对中医药监管的力度不断加大，多成分定量测定已逐渐成为中成药复方制剂常用的质量评价模式，一测多评法利用中成药复方制剂中所含成分内在的函数和比例关系，通过测定其中一个代表性成分(易得、稳定、廉价、有效)，建立其他成分与该成分间的相对校正因子，达到同时测定中成药复方制剂中多成分含量的目的，有效地解决了多成分同时测定检验成本高、操作繁琐等不足，一测多评法已成为中成药复方制剂质量评价的发展趋势。为全面有效地控制竭红跌打酊的产品质量，本文以竭红跌打酊中主要药味红花、儿茶和苏木为研究对象，选取儿茶素为内标物，建立儿茶素与羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B之间的相对校正因子，并计算其含量，探讨一测多评法对竭红跌打酊中5种成分同时定量测定的可行性及准确性。

1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；竭红跌打酊(规格：300 ml/瓶；批号：170085、170092、180013)来源于国药集团冯了性(佛山)药业有限公司；羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-201810，含量：93.1%)、儿茶素对照品(批号：110877-201604，含量：99.2%)、表儿茶素对照品(批号：110878-201703，含量：99.7%)、(±)原苏木素B对照品(批号：111882-201302，含量：89.9%)均来源于中国食品药品检定研究院；巴西苏木素对照品(批号：474-07-7，含量：98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脱(0～13.0 min，10.0%A；13.0～19.0 min，10.0%A→15.0%A；19.0～31.0 min，15.0%A→22.0%A；31.0～43.0 min，22.0%A→36.0%A；43.0～50.0 min，36.0%A→10.0%A)；0～19.0 min时在403 nm[2-5]波长下检测羟基红花黄色素A，19.0～50.0 min在280 nm[2,6-9]波长下检测儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B；流速：0.9 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液 分别精密称取羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B对照品各适量，用80%甲醇分别制成每1 ml含0.698、1.012、0.576、0.382、0.218 mg的对照品储备液。

2.2.2 混合对照品溶液 依次精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品储备液各2.5 ml，用80%甲醇[10]制成羟基红花黄色素A 0.034 9 mg/ml、儿茶素0.050 6 mg/ml、表儿茶素0.028 8 mg/ml、巴西苏木素0.019 1 mg/ml、(±)原苏木素B 0.010 9 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2.3 线性考察混标溶液 依次精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品储备液各2.0 ml，置于同一10 ml量瓶中，摇匀，作为线性考察混标溶液Ⅰ，再精密吸取线性考察混标溶液Ⅰ各适量，依次用80%甲醇稀释2、4、8、16、20倍，分别制成线性考察混标溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。

2.2.4 竭红跌打酊供试品溶液 精密量取竭红跌打酊1.0 ml，置25 ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，制成竭红跌打酊供试品溶液。

2.2.5 阴性样品溶液 按竭红跌打酊质量标准项下的处方和制备工艺，分别制备不含红花的阴性样品、不含儿茶的阴性样品和不含苏木的的阴性样品，分别按照“2.2.4”项下所述的竭红跌打酊供试品溶液制备方法制成相应的3种阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性与专属性试验 精密吸取混合对照品溶液、竭红跌打酊供试品溶液、红花阴性样品溶液、儿茶阴性样品溶液和苏木阴性样品溶液各适量，依法进样测定，结果见图1。所测色谱峰羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B与其相邻色谱峰能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数以所测各成分色谱峰计均大于4 500，阴性样品对测定无干扰。

2.3.2 标准曲线的考察 精密吸取“2.2.3”项下制备的线性考察混标溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各适量，分别依法进样检测，记录羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B峰面积，以质量浓度X为横坐标，羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.2”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，记录羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B峰面积，结果所测5个成分峰面积的RSD分别为1.01%、0.66%、1.09%、1.14%、1.23%。

图1 色谱图

注：A.混合对照品，B.竭红跌打酊，C.红花阴性样品，D.儿茶阴性样品，E.苏木阴性样品；1.羟基红花黄色素A，2.儿茶素，3.表儿茶

素，4.巴西苏木素，5.(±)原苏木素B

2.3.4 重现性试验 取同一批次竭红跌打酊，按照“2.2.4”项下竭红跌打酊供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，依法进样测定，分别计算羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的含量，结果显示，所测组分羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B含量的RSD依次为1.42%、1.35%、0.51%、1.72%和0.84%。

2.3.5 稳定性试验 取同一批次竭红跌打酊样品的同一份供试品溶液，分别于室温下0、2、4、6、12、16、24 h进样检测，记录羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的峰面积，结果表明，竭红跌打酊供试品溶液在室温下24 h内稳定，峰面积RSD分别为0.98%、0.59%、1.05%、1.08%、1.19%。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的竭红跌打酊适量，分别精密量取0.5，分置不同的25 ml量瓶中，依次精密加入羟基红花黄色素A对照品溶液(0.374 mg/ml)、儿茶素对照品溶液(0.569 mg/ml)、表儿茶素对照品溶液(0.307 mg/ml)、巴西苏木素对照品溶液(0.215 mg/ml)和(±)原苏木素B对照品溶液(0.133 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml，按照“2.2.4”项下竭红跌打酊供试品溶液制备方法制备加样供试品溶液，依次进样测定，结果所测成分羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的平均加样回收率见表2。

2.4 相对校正因子(fk/s)的计算 精密吸取“2.2.3”项下制备的线性考察混标溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各适量，依法进样测定羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的峰面积，以儿茶素为内标物，按照相对校正因子计算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W为所测成分质量浓度，A为所测成分峰面积，k为内标物，s为其他待测成分)分别计算内标物与羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的相对校正因子，结果见表3。

表2 羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的回收率

表3 以儿茶素为内标的相对校正因子

2.5 相对校正因子的重复性考察 取“2.2.2”项下制备的混合对照品溶液分别进样测定，考察Agilent 1260型高效液相色谱仪、Waters 2695型液相色谱仪和Agilent Zorbax SB-C18色谱柱、Kromasil C18色谱柱、Hypersil ODS C18色谱柱对相对校正因子的影响，按照相对校正因子计算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W为所测成分质量浓度，A为所测成分峰面积，k为内标物，s为其他待测成分)计算相对校正因子，结果见表4。试验结果表明，不同仪器与不同色谱柱对所测成分羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的相对校正因子无显著影响。

表4 各因素对相对校正因子的影响

2.6 待测成分色谱峰定位 保证所建立的相对校正因子得以准确应用的前提条件是色谱峰的准确定位。以表儿茶素为内标物，采用相对保留值法考察在不同仪器、不同色谱柱条件下羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B与内标物儿茶素的相对保留值。实验结果表明,不同仪器、不同色谱柱条件下，羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B与内标物儿茶素的相对保留值无明显差异，结果见表5。

3 样品测定

取3批竭红跌打酊，批号为170085、170092、180013，分别采用外标法和一测多评法测定竭红跌打酊中羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的含量，结果见表6。实验结果表明,外标法所测结果和一测多评法计算结果无显著差异，相对校正因子可信度较高，所建立的一测多评法可用于竭红跌打酊中羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B含量的同时测定。

4 讨论

4.1 流动相的选择 流动相对色谱峰具有明显的影响，通过比较所测各成分羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B色谱峰的峰形、分离度及保留时间，笔者对比考察了甲醇-水流动相体系、乙腈-水流动相体系[10]、乙腈-0.2%磷酸溶液流动相体系[4-5]、乙腈-0.2%冰醋酸溶液流动相体系[9]和乙腈-0.2%甲酸溶液流动相体系[3,11]，优选最佳的流动相体系为乙腈-0.2%磷酸溶液流动相体系。在此实验基础上，通过对乙腈与0.2%磷酸溶液流动相比例的不断摸索和对比试验，最终确定以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相，按照文中“2.1”项下的梯度洗脱比例实现对竭红跌打酊中羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B含量的同时测定。

4.2 待测成分的选择及内标物的确定 竭红跌打酊是由红花、儿茶、苏木、当归尾、白矾等10味中药材加工而成的中成药复方制剂，所含成分复杂，具有多成分多靶点的作用特点，红花、苏木、当归尾活血散瘀、消肿止痛，为方中君药；附以乳香、没药、血竭祛瘀止痛、消肿生肌，儿茶、白矾收敛止血，芦荟清热散瘀，安息香行气活血，诸药合用，共成散瘀消肿、活络止痛之效。根据中药质量标志物确定原则，以君药为主，兼顾臣、佐、使药的原则，本文选取竭红跌打酊中主要药味红花的代表性成分羟基红花黄色素A、苏木的代表性成分巴西苏木素和(±)原苏木素B、儿茶的代表性成分儿茶素和表儿茶素为检测指标，同时选取对照品稳定、价格较低的儿茶素为内标物，通过建立内标物儿茶素与羟基红花黄色素A、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B的相对校正因子，实现一测多评法对竭红跌打酊中多指标成分的同时测定。

表5 各因素对相对保留值的影响

表6 含量测定结果(n=3，mg/ml)

5 小结

本实验建立的一测多评法同时测定竭红跌打酊中羟基红花黄色素A、儿茶素、表儿茶素、巴西苏木素和(±)原苏木素B含量具有操作便捷、结果准确、专属性强、重复性好等优点，有效地解决了多成分同时测定质量评价模式检验成本高的问题，为提高和修订竭红跌打酊的质量标准提供了实验数据。