尖孢镰刀菌诱导产酶及同步糖化发酵产纤维素乙醇

孙曼钰 李栋梁 舒月力

摘要：以尖孢镰刀菌为研究对象，探究其诱导产酶及同步糖化发酵产纤维素乙醇的影响。选取不同诱导底物、产酶培养基以及发酵时间，通过测定发酵液中羧甲基纤维素酶活性和木聚糖酶活性，确定最佳诱导产酶条件。最佳诱导产酶培养基：底物30 g/L，羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸铵3 g/L，pH值6.0。最佳诱导产酶的底物为小麦秸秆，发酵4 d羧甲基纤维素酶活性达到12.40 U/mL，木聚糖酶活性达到 930.9 U/mL。尖孢镰刀菌诱导所产纤维素酶具有较好的pH值稳定性和温度稳定性，在一定程度上能弥补真菌纤维素酶耐碱性差和细菌纤维素酶活性低的不足。将其作为乙醇发酵菌种进行木质纤维素同步糖化发酵，在3%葡聚糖负荷下，96 h生成乙醇12.23 g/L，乙醇得率为71.81%。将其与酿酒酵母混菌同步糖化发酵，48 h添加木糖利用率最高，96 h生成乙醇19.11 g/L，乙醇得率82.11%。

关键词：尖孢镰刀菌;纤维素酶;同步糖化发酵;乙醇

中图分类号： S188+.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0277-05

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%左右，高效、廉价地利用木质纤维素转化为如燃料乙醇等化工产品，是由石油基向生物基经济社会转型的基础[1]。木质纤维素的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素。在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障[2]。

纤维素酶是一类能够将纤维素降解为寡糖和纤维二糖并最终水解为葡萄糖的多组分酶系，广泛存在于自然界的生物如真菌、细菌、少数动物体内，不同微生物所产纤维素酶系组成差别较大：木霉纤维素酶的β-葡萄糖苷酶活性较低，而黑曲霉纤维素酶的外切葡聚糖酶活性较低[3]。尖孢镰刀菌具有较高的纤维素酶产量，而且前人对其纤维素分解系统的各个成分有较具体的研究[4]。同时，尖孢镰刀菌也是一种能够利用己糖和戊糖发酵生产乙醇的丝状真菌。此外，它能夠产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，使之能够在深层液体或者固态培养条件下附着在木质纤维素底物上。尖孢镰刀菌的强致病性与其所产纤维素酶有密切关系。由于植物病原菌通过渗入外细胞层和侵入不同的植物组织而感染宿主，感染期间病原菌会完全破坏细胞壁结构中纤维素等多聚物，对纤维素降解能力很强，因此对该菌纤维素降解系统的研究最初是基于防治的目的。随着研究的深入，尖孢镰刀菌的高产纤维素酶的性能逐渐被认识，其所产纤维素酶为胞外酶，且酶系完全[5]。纤维素酶发酵生产过程包括原料预处理、发酵过程2个阶段，原料主要包括麸皮、秸秆、酒糟、废纸浆等[6]。在进行纤维素酶发酵生产时，选择合适的发酵原料很关键。纤维素酶是诱导酶，碳源对菌种的产酶能力影响特别大。同时，培养基和发酵时间对菌种产酶能力也有影响。

同步糖化发酵（simultaneous sacchrification and fermentation，SSF）采用纤维素酶对木质纤维素进行水解，同时加入乙醇发酵菌，使水解与发酵在同一反应器内进行，且酶水解过程中得到的糖类能迅速被微生物利用生产乙醇。由于酶解过程中产生的葡萄糖和纤维二糖会很快积累，会对纤维素酶产生非常显著的终端产物反馈抑制作用，抑制酶解，使得最终的糖的转化率降低。同步糖化发酵可以消除纤维素酶受葡萄糖和纤维二糖的终产物抑制，提高纤维素酶解的效果并能降低酶制剂的用量，具有染菌风险小、转化率高、获得乙醇浓度较高等优点[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料、试剂与仪器 柠条锦鸡儿（以下简称柠条）采自内蒙古凉城县，小麦秸秆采自山东省枣庄市;水稻秸秆采自湖南省永州市。试验地点为天津科技大学生物工程学院，试验时间为2017年3—4月，主要试剂包括羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇。主要仪器：微型植物粉碎机（DF-15），购自温岭市林大机械有限公司;立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS），购自上海申安医疗器械厂;循环水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，购自巩义市予华仪器有限责任公司;水分仪（MJ33），购自瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司;高效液相色谱（1260LC），购自安捷伦科技（中国）有限公司;恒温水浴锅（HH-2），购自常州市凯航仪器有限公司;电热鼓风干燥箱（DH-101），购自天津市中环实验电炉有限公司;超净工作台（VS-1300L-U），购自苏州安泰空气技术有限公司;恒温培养振荡器（ZWYR-D2401），购自上海智城分析仪器制造有限公司;水浴振荡器（HZS-H），购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;精密电子天平（MS204S），购自瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司;pH计（Delta 320），购自梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司。

1.1.2 菌种与培养基 尖孢镰刀菌菌种由天津科技大学生物工程学院应用微生物与酶工程实验室提供;酵母由笔者所在实验室提供。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，若制固体培养基加琼脂20 g/L，不调节pH值。酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L，若制固体培养基加琼脂20 g/L，不调节pH值。发酵产酶培养基A：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸铵 3 g/L，pH值6.0。发酵产酶培养基B：底物 40 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，氯化钙0.3 g/L，硫酸镁 0.3 g/L，磷酸氢二铵 10 g/L，磷酸二氢钠6.94 g/L，磷酸氢二钠9.52 g/L，pH值 6.0。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌产酶培养基的确定 在PDA平板上接种菌丝，28 ℃培养4 d，平板中长出的菌丝接种PDA培养基中，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养2 d，得到菌液。取3 mL菌液分别转接于发酵产酶培养基A和B，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养。在培养后3、4、5 d分别取发酵液12 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶液。

1.2.2 尖孢镰刀菌产酶诱导底物的确定 选取3种诱导底物，分别为柠条、麦秆和水稻秸秆。以上原料自然风干，剪成2～3 cm小段，用植物试验粉碎机粉碎，过20 mm筛。用于成分分析的秸秆原料在空气中干燥至水分低于10%。

在PDA平板上接种菌丝，28 ℃培养4 d，平板上长出的菌丝接种于PDA培养基中，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养 2 d，得到菌液转接于发酵产酶培养基A，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养。在培养后3、4、5 d分别取发酵液12 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶液。

1.2.3 尖孢镰刀菌产酶发酵时间的确定 在PDA平板上接种菌丝，28 ℃培养4 d，平板中长出的菌丝接种于PDA培养基中，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养2 d，得到菌液。取3 mL菌液转接于发酵产酶培养基A，28 ℃、150 r/min摇床振荡培养。在培养后3、4、5 d分别取发酵液12 000 r/min离心 20 min，上清即为粗酶液。

1.2.4 酶活性的测定 酶活性定义[8]：在50 ℃、pH值4.8条件下，1 min内由1 mL酶解液催化底物水解生成1 μg葡萄糖（木糖）所需的酶量，定义为1个酶活性单位，以U/mL表示。

CMC-Na酶活性测定：于试管中加入2 mL由pH值为4.8的柠檬酸缓冲溶液配制的1% CMC-Na，预热5 min，再向试管中加入0.5 mL粗酶液，对照管中加入底物作空白对照。50 ℃水浴30 min，向试管和对照管中分别加入3 mL DNS，沸水浴10 min，迅速冷却至室温，定容至25 mL，混匀，于540 nm下测吸光度。酶活计算公式如下：

x=D×（1/0.5）×n×2。

式中：X为羧甲基纤维素（还原糖）酶活性，U/mL;D为吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg;1/0.5为换算成酶液 1 mL;n为酶样的稀释倍数;2为时间换算系数。

木聚糖酶活性测定[9]：与CMC-Na酶活性测定过程基本相似，将底物换成木聚糖，柠檬酸缓冲液换成pH值为4.4的乙酸-乙酸纳缓冲液。于试管中加入2 mL由pH值为5.5的乙酸-乙酸纳缓冲液配制的1%木聚糖，预热5 min，再向试管中加入2 mL经适当稀释的酶液，对照管中加入底物作空白对照。40 ℃水浴30 min，向试管和对照管中分别加入5 mL DNS，沸水浴10 min，冰浴5 min，定容至25 mL，混匀，于 540 nm 处测吸光度。酶活计算公式如下：

xD=（Da-Db）×K+C0M×t×1 000;

x′=XD×Dt。

式中：xD为稀释酶液中木聚糖酶的活性，XD值应在0.04～0.10 U/mL 之间;Da为酶反应吸光度;Db为酶空白样吸光度;K为标准曲线斜率;C0为标准曲线截距;M为木糖的摩尔质量;t为酶解反应时间，min;1 000为转化因子，1 mmol=1 000 μmol;x′为试样中木聚糖酶的活力，U/mL;Dt为试样稀释倍数。

1.2.5 同步糖化发酵 尖孢镰刀菌不仅可以诱导产酶，还可以用来进行木质纤维素同步糖化发酵。将麦秆与 0.5 mol/L NaOH溶液按料液比1 ∶ 20（g ∶ mL）混合，于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃预处理1 h，固体残渣水洗至中性，烘干，粉碎，过 20 mm 筛。将上述经NaOH处理后的物料按30 mg/mL葡聚糖固体负荷进行同步糖化发酵，反应体积为100 mL。纤维素酶（celluclast） 1.5 L和β-葡萄糖苷酶用量按照25 FPU/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10 mg/g葡聚糖加入酶体系中，于50 ℃、200 r/min下预酶解6 h。

将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点，按照5%接种量将尖孢镰刀菌种子液接入降解液中，于35 ℃、150 r/min 下培养120 h。在接种后6、12、24、48、72、96、120 h取样，样品12 000 r/min下离心5 min，取上清，用高效液相色谱法测葡萄糖、木糖和乙醇含量。所使用的色谱柱为Aminex HPX-87P（Bio-Rad）有机酸分析柱，5 mmol/L稀硫酸为流动相，使用前经0.22 μm滤膜过滤并超声脱气30 min。测定时柱温60 ℃，流速0.6 mL/min[10]。

2 结果与分析

2.1 尖孢镰刀菌产酶诱导底物和培养时间的确定

纤维素酶是诱导酶，碳源对菌种的产酶能力影响很大，不同碳源对纤维素酶的合成有不同的诱导作用，一般天然纤维素原料更有利于纤维素酶的合成。选取水稻秸秆、小麦秸秆和柠条为尖孢镰刀菌诱导底物，分别在发酵后3、4、5 d取样测定其羧甲基纤维素（CMC）酶活性和木聚糖酶活性。由图1可知，木本植物柠条诱导产酶效果远不如草本植物水稻和小麦秸秆。发酵后4 d水稻秸秆和小麦秸秆的CMC酶活性是柠条的10倍，木聚糖酶活性在300～931 U/mL之间，高于柠条，同时也高于其他文献研究。葛春辉等从垃圾堆肥中分离出能用羧甲基纤维素钠为唯一碳源的降解菌，能产生胞外纤维素酶，最佳酶活仅达到376 U/mL[11]。这是由于不同植物种类中木质素、纤维素、半纤维素的分布和含量不一样。木本类植物具有较高的纤维素和木质素含量，纤维素以微纤维形式存在，纤维素链之间氢键相互连接[12]。木质素缠绕在纤维素周围，且与半纤维素成分紧密相连，共同维持着纤维素的完整性及结构的刚性，这种结构阻碍了微生物与纤维素的接触。草本类植物中的半纤维素含量较高[13]，内部纤维素结晶结构相对较疏松，所以诱导产酶效果优于木本植物。

对于尖孢镰刀菌产酶而言，无论是CMC酶活性还是木聚糖酶活性都是发酵后4 d远高于发酵后3、5 d。

2.2 尖孢镰刀菌产酶培养基的确定

纤维素酶是诱导酶，碳源对菌种的产酶能力影响特别大。同时，培养基和发酵时间的选择对菌种产酶能力也有影响。如图2所示，分别选取水稻秸秆和小麦秸秆为底物，选取A、B、C 3种不同培养基诱导产酶，在发酵后4 d取样测其CMC酶和木聚糖酶活性。水稻和小麦秸秆诱导下A培养基CMC酶活分别为12.40、10.82 U/mL，木聚糖酶活为930.92、311.49 U/mL;而B培养基中CMC酶活为2.41、3.43 U/mL，木聚糖酶活为158.86、78.65 U/mL;C培养基中CMC酶活为6.23、5.64 U/mL，木聚糖酶活为423.65、145.78 U/mL。本试验所用3种培养基所产纤维素酶活都要高于其他文献报道。其中，2种底物诱导下A培养基产酶效果都要优于B、C 2种培养基，由于A培养基中氮源含量高于B种培养基，丰富的氮源有利于尖孢镰刀菌的生长，同时有利于其产酶。

对于同是草本植物的水稻秸秆和小麦秸秆，水稻秸秆诱导产酶效果明显优于小麦秸秆。同时，尖孢镰刀菌诱导产酶具有较好的pH值稳定性和温度稳定性，尤其对强碱环境的耐受力在一定情况下弥补了真菌纤维素酶耐碱性差和细菌纤维素酶活力不足等缺点。因此，该菌有进一步研究的意义。

2.3 尖孢镰刀菌同步糖化发酵

根据再生能源实验室（NREL）2步酸水解法对未处理小麦秸秆和碱处理小麦秸秆进行成分分析，结果表明，纤维素含量由32.73%增加到62.81%，半纤维素含量由22.18%变为22.66%。经过NaOH预处理后，小麦秸秆中纤维素和半纤维素的含量明显升高，木质素含量明显降低，表明NaOH预处理去除了秸秆中的大量木质素，从而使得纤维素和半纤维素比例相对升高。有效的预处理方式能提高剩余多聚糖的酶可及性及可利用糖的浓度，从而最终提高乙醇产量[14]。

图3-a为尖孢镰刀菌同步糖化发酵葡萄糖利用情况，与传统发酵菌酿酒酵母相比较，0～12 h内酿酒酵母迅速利用葡萄糖，12 h后基本利用完全;尖孢镰刀菌试验组原料继续酶解，葡萄糖浓度增加;12～48 h，尖孢镰刀菌开始利用葡萄糖，但是相比于酿酒酵母，其利用周期较长，利用速率较慢;48～96 h基本趋于平稳。

如图3-b所示，尖孢镰刀菌对于2种菌的木糖利用率稍高于酿酒酵母。酿酒酵母基本上不利用木糖，酿酒酵母作为传统的乙醇发酵菌株具有耐受能力强、不易染菌等优点，但是天然的酿酒酵母不具有木糖代谢能力，木糖发酵是利用纤维素类物质生产乙醇的关键技术难点之一[15]。24～48 h内尖孢镰刀菌试验组木糖浓度由12 h的12.78 g/L降低到6 g/L左右，48 h后基本趋于平稳。但是2种菌的木糖利用率都较低，五碳糖与六碳糖的共利用是目前同步糖化发酵存在的最大问题。对于木糖的利用，目前最常见的手段是通过人工构建木糖代谢途径和构建可以利用木糖的基因工程酿酒酵母[16]。但研究者发现，即使成功构建木糖代谢途径，在葡萄糖和木糖共发酵中，酿酒酵母的木糖利用能力仍然很弱[17]。

图3-c为尖孢镰刀菌同步糖化发酵乙醇生成情况，酿酒酵母12 h内迅速利用葡萄糖生成乙醇，达16 g/L左右，之后基本趋于平稳;尖孢镰刀菌生成乙醇周期较长，12～60 h内同时利用葡萄糖和木糖，一部分用于维持菌体自身活力，另一部分用于产乙醇，可生产乙醇12 g/L左右。范金霞等以尖孢镰刀菌为研究对象，设置不同比例的葡萄糖木糖混合发酵生产乙醇，结果表明，葡萄糖在混合糖中被优先利用[18]。葡萄糖的存在限制了木糖的利用，并且当葡萄糖消耗完，尖孢镰刀菌对木糖的利用周期较长。虽然尖孢镰刀菌用于同步糖化发酵不如传统的酿酒酵母产量高，但其對木糖的利用以及诱导产酶都具有较大的研究意义。Paschos等使用预处理小麦秸秆为原料，由尖孢镰刀菌生产木质纤维素酶液降解，酿酒酵母F12发酵生产燃料乙醇，减少成本的同时得到较高的乙醇产量[19]。

2.4 混菌培养同步糖化发酵

酿酒酵母作为传统的乙醇发酵菌株具有耐受能力强、不易染菌等优点，但是天然的酿酒酵母不具有木糖代谢能力，而上述试验证明尖孢镰刀菌能利用少量木糖，提高木糖利用率和乙醇生成率。所以，将酿酒酵母和尖孢镰刀菌共培养进行同步糖化发酵。以碱处理小麦秸秆为原料，在3%葡聚糖负荷下进行同步糖化发酵，在发酵初始阶段接入酿酒酵母，分别在发酵24、48、72 h后接入尖孢镰刀菌，葡萄糖、木糖和乙醇利用情况如图4所示。图4-a为葡萄糖利用情况，3种情况下葡萄糖利用情况基本一致，12 h内酿酒酵母基本上将葡萄糖全部利用完。

对于木糖利用情况如图4-b所示，当葡萄糖存在时，木糖基本不被利用，所以0～24 h继续酶解，木糖继续生成;当葡萄糖消耗完全，接入尖孢镰刀菌，木糖开始逐渐被利用，3个时间段分别接入尖孢镰刀菌，木糖都会开始被利用，其中，24、48 h时接入木糖利用率稍高于72 h接入，可能是由于发酵后期发酵液中营养成分越来越少，菌种活性降低。尖孢镰刀菌的接入为起止时间，48 h后基本上不利用木糖。其中，48 h 添加尖孢镰刀菌试验组木糖利用率最高，3组试验中仍有8 g/L木糖未被利用。

图4-c为乙醇生成情况，前24 h 3组试验乙醇生成趋势基本一致，基本达到15 g/L左右;24～96 h，48 h加入尖孢镰刀菌试验组乙醇继续生成，96 h达到19.11 g/L，其他2组乙醇生成量最终达到17 g/L左右。2种菌混合发酵乙醇浓度19.11 g/L高于仅用酿酒酵母进行同步糖化发酵13.75 g/L。2种菌分不同时间段添加避免了菌种之间的拮抗作用[20]，但是由于同步糖化发酵过程会产生一些抑制物如糠醛、甘油等，这些物质会影响尖孢镰刀菌对木糖的利用，所以，木糖的利用仍是木质纤维素同步糖化发酵的一个难题。

3 結论

纤维素酶是诱导酶，碳源、培养基和发酵时间对菌种的产酶能力影响特别大。本研究对尖孢镰刀菌诱导产酶底物、培养基以及发酵时间进行分析，确定了水稻秸秆为最佳诱导产酶底物，最佳诱导产酶培养基为：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸铵3 g/L，pH值6.0。在发酵后4 d羧甲基纤维素酶活性12.40 U/mL，木聚糖酶活性达到930.92 U/mL。尖孢镰刀菌同样用于木质纤维素的同步糖化发酵产纤维素乙醇，可以同时利用葡萄糖和木糖， 木糖利用率达到49.53%，96 h生成乙

醇12.23 g/L。

尖孢镰刀菌诱导所产纤维素酶具有较好的pH值稳定性和温度稳定性，在一定程度上能弥补真菌纤维素酶耐碱性差和细菌纤维素酶活性低的不足。在纤维乙醇研究中，2种菌分不同时间段添加，避免了菌种之间的拮抗作用，相比于单一菌种发酵，木糖利用率提高，乙醇浓度由13.75 g/L提高到19.11 g/L。尖孢镰刀菌虽利用木糖产乙醇周期较长，但是对于利用纤维素类物质和木糖发酵生产乙醇这一难点的解决以及利用基因工程技术培育新的菌株具有重要的研究意义。

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