不同氮磷比对小球藻叶绿素荧光参数及生长的影响

薄香兰 刘兴 窦勇

摘要：以小球藻（Chlorella vulagris）为研究对象，研究不同氮磷比对其叶绿素荧光、叶绿素含量和细胞密度的影响，以期找到小球藻生长最适的氮磷比，为小球藻的规模化培养提供基础资料。结果表明：不同浓度的氮磷比对小球藻的叶绿素荧光、叶绿素含量和细胞密度有显著影响，各处理组均呈上升趋势，其中17.30 ∶ 1处理组的最大光能转化速率Fv/Fm、潜在活力Fv/Fo、实际光能转化效率ΦPS Ⅱ和量子效率Yield、相对电子转化速率ETR均高于其他处理组，34.60 ∶ 1 处理组叶绿素含量和细胞密度最高，其值分别为3 231.81 μg/L和1.07×107个/mL。138.40 ∶ 1处理组上升趋势最小，且各处理组的荧光参数指标在试验后8 d开始呈下降趋势。小球藻在氮磷比为17.30 ∶ 1生长最好。

关键词：小球藻;叶绿素荧光参数;叶绿素含量;细胞密度;氮磷比

中图分类号： S184  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0169-04

氮和磷是藻类生长中最常见的限制因子[1]，氮是蛋白质和叶绿素等物质的组成成分，限氮会影响植物叶绿素的合成，进而影响到其光合作用[2]。磷作为藻类生长发育的必需元素直接参与光合作用的各个过程，限磷会影响光合磷酸化水平，使代谢合成受阻，光合速率下降[3]。因此，水体中的氮磷比（N/P）直接影响藻类细胞的生长及物质的积累[4]。目前关于氮磷比对藻类的研究大都集中在对藻类生物量和群落结构变化的影响上[5-6]，对叶绿素荧光动力学参数和叶绿素含量的研究比较少。

叶绿素荧光現象是在1834年由传教士Brewster最先发现的[7]，1932年由Kautsky和Hirsch发现此现象和光合特性之间的关系[8]，1986年Schreiber发明了可以检测荧光诱导动力学的PAM仪器（pulse-amplitude-modulation）[9]。作为光合作用的良好探针，叶绿素荧光参数是鉴定藻类耐逆境能力的良好指标之一，具有快速、准确、简单的特点[10-11]。小球藻在分类上属于绿藻门，个体微小，营养丰富，易于繁殖，在动物饲料、食品添加剂、美容产品、食品开发、医药保健等领域都有巨大的应用潜力。本试验利用叶绿素荧光仪（PHYTO-PAM WALZ），在保持磷不变的基础上，设置5个氮磷比梯度，通过检测叶绿素荧光参数和藻密度，以期找到适合小球藻生长的氮磷比，为小球藻的大规模培养提供参考依据，同时，为叶绿素荧光现象在确定藻类适宜氮磷比值上的可行性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与时间地点

试验用小球藻（Chlorela vulagris）来源于天津市水产生态及养殖重点实验室。

试验时间为2017年5月10—20日。试验地点为天津农学院水产生态及养殖重点实验室。

1.2 培养条件

将初始密度为1×106个/mL的小球藻藻液以1 ∶ 1的比例接种于蓝绿培养基（BG-11 medium for blue green algae，BG-11培养基）中，以硝酸钠（NaNO3）为氮源，设置5个氮磷比梯度，分别为8.65 ∶ 1（NaNO3浓度为2.5 mol/L）、17.30 ∶ 1（NaNO3浓度为5 mol/L）、34.60 ∶ 1（NaNO3浓度为10 ml/L）、69.20 ∶ 1（NaNO3浓度为20 mol/L）、138.40 ∶ 1（NaNO3浓度为40 mol/L），光照条件为60 μmol/（m2·s），温度为25 ℃，光—暗比为12 h—12 h，每组设定3个平行，于恒温光照培养箱中静置培养，每天定时摇动4次，以防小球藻细胞附壁及下沉。

1.3 试验仪器

叶绿素荧光仪（PHYTO-PAM WALZ）、超净工作台（SW-CJ-1FD上海博讯实业有限公司医疗设备工厂）、高压蒸汽灭菌锅（HVE-50 HIRAYMA仪器制造公司）、生物显微镜（E200日本Nikon）、藻类培养箱（AL-36美国珀尔瓦西）、电子天平（AS2202X2 RADWAG）。

1.4 培养基

1.4.1 微量元素溶液（A5） 将2.86 g的硼酸（H3BO3）、1.86 g 的四水氯化锰（MnCl2·4H2O）、0.22 g的七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、0.39 g的钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、0.08 g的五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.05 g的六水硝酸钴 [CO（NO3）2·6H2O]依次溶于1 L的蒸馏水中。

1.4.2 BG-11培养基 将1.5 g的硝酸钠（NaNO3）、0.052 g 的磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、0.075 g的硫酸镁（MgSO4·7H2O）、0.036 g的氯化钙（CaCl2·2H2O）、0.006 g的柠檬酸、0.006 g的柠檬酸铁胺、0.001 g的EDTA（Na2）、0.2 g 的碳酸钠（Na2CO3）、1 mL的A5溶液依次溶于1 L的蒸馏水中。

1.5 测定方法

将处于对数期的小球藻接种到配好的培养基中，并记录为试验的0 d，在试验后0、2、4、6、8、10 d定时取样，测定叶绿素荧光参数、叶绿素含量和藻密度。

1.5.1 叶绿素荧光参数的测定 利用浮游植物分类荧光仪（PHYTO-PAM WALZ）对叶绿素荧光各个参数进行测定，打开Phyto Win软件，先放置1 cm样品（每次体积应统一）在比色皿中暗适应15 min，启动仪器测定初始荧光产量（Fo），饱和脉冲后测定最大荧光产量（Fm），以此计算出最大光能转化效率（Fv/Fm），打开预先设定好的光化学强度，进行1 min的照射（仪器指示灯变绿为光化学结束），待荧光值稳定后，测定出光化学后初始荧光（Fs）和最大荧光（Fm′）。Settings窗口中将Meas. Freq.设置为32，切换到Channeles窗口，点击CHL，测出叶绿素的含量。测定的叶绿素荧光参数有Fo、Fm、Fo′、Fm′、Fs，并根据荧光仪提供的公式计算出Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、ETR、ΦPSⅡ等荧光参数。

1.5.2 藻密度测定 小球藻密度测定通过血球计数板计数获得。

1.6 数据处理

采用SPSS 19.0进行单因素方差分析和多重比较，利用Excel 2007进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同氮磷比对小球藻叶绿素荧光活性的影响

2.1.1 不同氮磷比对小球藻Fv/Fm的影响 Fv/Fm反映了光反应中心PS Ⅱ的最大量子产量，即最大光能转化效率，在受到环境条件胁迫时，其值会降低，此指标常用来判断植物是否受到条件抑制[12]。由图1可知，在整个培养期间，各处理组的Fv/Fm均呈上升趋势，以17.30 ∶ 1处理组最高，34.60 ∶ 1 次之，138.42 ∶ 1最低，至培养结束时，34.60 ∶ 1、8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1、138.40 ∶ 1处理组的最高值各维持在17.30 ∶ 1处理组最高值的97.73%、91.84%、86.81%、80.58%，说明本试验设置的5组氮磷比对小球藻Fv/Fm值没有抑制作用，同时，各组的Fv/Fm均在8 d后呈下降趋势，说明此时各组的氮磷比都不能满足藻类的生长需求，推测原因是营养盐消耗殆尽的结果。17.30 ∶ 1处理组的Fv/Fm从试验后 2 d 开始就高于其他各组，说明小球藻对该浓度的氮磷比适应良好。

2.1.2 不同氮磷比对小球藻Fv/Fo的影响 Fv/Fo反映了光反应中心PS Ⅱ的潜在活性，其值受到胁迫时下降，是用来判断光合作用是否受到抑制的指标之一[13]。由图2可知，各处理组的Fv/Fo在试验后0～8 d呈上升趋势，在试验后8 d后开始下降，培养结束时，以17.30 ∶ 1处理组最高，34.60 ∶ 1次之，138.40 ∶ 1最低。各组Fv/Fo值在试验后2 d开始上升，说明此时的氮磷比都能满足光反应中心PS Ⅱ吸收量子的能力，在试验后 8 d 各组都呈下降趋势，表明此时小球藻的光合作用开始受到抑制。

2.1.3 不同氮磷比对小球藻ΦPS Ⅱ的影响 ΦPS Ⅱ是指光反应中心PS Ⅱ的实际光能转化效率[14]。由图3可知，所有处理组的ΦPS Ⅱ的在试验后0 d均维持在0.28±0.01，且随着时间增加呈上升趋势，以17.30 ∶ 1组的ΦPS Ⅱ值最高，之后依次为 34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。到试验后 10 d，138.40 ∶ 1处理组的ΦPS Ⅱ维持在17.30 ∶ 1处理组的75.11%。

2.1.4 不同氮磷比对小球藻Yield的影响 Yield指在光合作用中每吸收一个光量子，所固定CO2分子数或者释放O2的分子数[15]。由图5可知，各处理组的Yield均在第8 d时达到峰值，至培养结束时，17.30 ∶ 1处理组较峰值下降93.30%，34.60 ∶ 1 处理组较峰值下降92.42%，8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1 和138.40 ∶ 1处理组较峰值下降差别不大，分別为88.46%、88.51%、88.56%。PSⅡ量子下降的速率，说明光反应中心受抑制的程度越严重，代谢合成受到阻碍程度越高。

2.1.5 不同氮磷比对小球藻ETR的影响 ETR表示光反应中心PS Ⅱ光合电子的传递速率，图5显示， 在小球藻的一次性培养过程中，各处理组的ETR值呈上升趋势，依次为 17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在试验后8 d出现下降趋势。

2.2 不同氮磷比对小球藻叶绿素含量的影响

藻体内的叶绿素含量与其光合作用、生长密切相关。图6表明，随着培养时间的增加，各处理组叶绿素含量不断增加，培养结束时，以34.60 ∶ 1处理组叶绿素含量最高，其值为3 231.81 μg/L，17.30 ∶ 1处理组次之，其值为 2 964.44 μg/L，接下来依次为69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1>8.65 ∶ 1。

2.3 不同氮磷比小球藻细胞密度影响

不同氮磷比对小球藻细胞密度影响见图7，随着培养时间的增加，各处理组的细胞密度均呈上升趋势，其中以 17.30 ∶ 1 μmol/L 处理组细胞密度增加最快，在试验后10 d，细胞密度达到1.07×107个/mL，为接种时的2.50倍。34.60 ∶ 1 处理组次之，培养结束时细胞密度为接种时的2.31倍。138.40 ∶ 1处理组增长最慢，培养结束时细胞密度为初始接种量的2.01倍。至培养结束时，各组细胞密度依次表现为34.60 ∶ 1>17.30 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。

3 讨论与结论

叶绿素荧光技术以藻类叶绿体的细胞器官为材料，反映光合作用过程中的光能吸收、激发能传递、光化学反应、电子传递、质子梯度的建立、ATP合成和CO2固定等光合作用的动态变化及各种外界因素对藻类的微妙影响[16-17]，其原理是藻类细胞内的叶绿素分子通过直接或间接吸收光量子获得能量后，从基态（低态能）飞跃到激发态（高态能）[18]，荧光是在电子从激发态返回到基态的过程中产生的[19]。荧光各参数指标与逆境受胁迫程度存在密切的相关性，当藻类在逆境条件发生光抑制时，叶绿素各荧光参数均呈下降趋势[20]。本试验结果表明，小球藻氮磷比为17.30 ∶ 1时各荧光参数指标值最高，在氮磷比为34.60 ∶ 1时叶绿素含量和细胞密度最高。从试验后0～8 d各组叶绿素荧光参数指标均呈上升趋势，说明本试验设置的5组氮磷比梯度并未对小球藻的光合系统产生明显的抑制作用，光能转化效率始终保持在较活跃的状态。从试验后8 d Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、Yield开始出现下降趋势，说明光反应中心PSⅡ受到损害，电子传递速率下降，导致光合作用各反应过程受到抑制，其主要是由于随着培养时间的增加，氮磷等营养盐消耗殆尽，不能满足藻类光合作用中吸收量子所需要的能量消耗[21]，进而表明本试验的小球藻生长周期为8 d。雷玉新等研究了不同氮磷质量浓度比的培养液对蓝藻生长和叶绿素的影响，发现水体中氮磷比为40 ∶ 1时，蓝藻的生长速率和叶绿素含量达到最大值[22]。李慧等研究发现，当氮磷比为10 ∶ 1时，铜藻幼苗的特定生长率最大[23]。陈庆荣等研究发现，在氮磷源充足的情况下，青岛大扁藻生长最佳的氮磷比是7.17 ∶ 1;当氮磷营养盐受到限制的情况下，青岛大扁藻生长最佳的氮磷比例是13.71 ∶ 1[24]。刘东艳等研究表明，氮磷比在16 ∶ 1的条件下，球等鞭金藻的生长速度最快，单位水体内的细胞数量最多，细胞内碳水化合物和蛋白质的含量也最高[25]。李冰研究发现，小球藻最适应的氮磷浓度比为16 ∶ 1[26]，与本试验研究结果相近。由于不同藻类对氮磷吸收利用率的差异，氮磷比对藻类生长的影响并不表现在一个固定数值上。

传统测定藻类最适氮磷比的方法就是在不同氮磷比的培养条件下测定藻类的细胞密度，这种方法比较耗时，而且准确度低。本试验通过测定叶绿素各荧光参数和叶绿素含量并结合细胞密度发现，各荧光指标、叶绿素含量与细胞密度有密切的相关性。按增长的速率来看，各组数值依次为17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在整个培养周期，各荧光指标和细胞密度有着显著的正相关关系。因此，利用叶绿素荧光各项参数的变化可以反映小球藻在不同培养条件下的生长情况。陈书秀等研究表明，雨生红球藻进行光合作用和生长最适氮浓度为1 760 μmol/L;最适磷浓度为 18.16 μmol/L，叶绿素相对含量均与细胞密度呈显著的正相关关系[27]，与本试验结果一致。目前，有许多学者利用叶绿素荧光技术来对藻类进行抗逆性研究，如王昭玉利用叶绿素荧光技术对氮、磷限制的响应，来判断山东青岛近海的氮、磷限制情况[28]。孙开明采用叶绿素荧光技术测定不同营养盐条件下的东海原甲藻的叶绿素参数与生长参数，研究外部营养盐浓度及吸收速率的关系[29]。许珍等利用此技术研究温度、光照度对汉斯冠盘藻、小环藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻生长的影响[30]。随着叶绿素荧光技术的进一步完善和机理的明确，此技术在藻类的其他方面也会发挥重要的作用。

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